وكان هذا العمل المنجز في ويدعمها معهد البوليتكنيك ورسيستر.

1-التحضير لديدان أسطوانية النمو المتوسطة (NGM) <ol><li>ل 1 لتر من وسائط الإعلام، والجمع بين أجار 20 غ ومصدر النيتروجين العضوي 2.5 g (مثلاً، باكتو-ببتون) وكلوريد الصوديوم الجيل الثالث 3g في قارورة 2 ل. إضافة 975 مل الماء المعقم.
	<ol><li>إضافة في حانة ضجة عقيمة. في حالة استخدام الوسائط التلقائية برير، وأنابيب اﻷوتوكﻻف ووسائط الإعلام لمدة 15 دقيقة؛ ينبغي أن تكون وسائل الإعلام يعقم لفترة أطول إذا تم زيادة حجم-</li>
	</ol></li> <li>تعيين وسائط الإعلام على لوحة إثارة، والسماح لتبرد.
	<ol><li>بمجرد وسائل الإعلام الحارة للمس (حوالي 60 درجة مئوية) أسيبتيكالي إضافة 1 مل من 1 م MgSO 4 &#9679; ح 2 س 1 مل كاكل 1 م 2، 25 مل من مشرف 4 و 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم 0.5% في الإيثانول-</li>
		<li>صب وسائط الإعلام (باليد أو بمضخة التلقائي) تحت الاندفاق الصفحي في 35 مم × 10 مم أطباق بتري معقمة. السماح لتجف تحت غطاء لمدة 1-2 أيام قبل الاستخدام. 
		ملاحظة: يجب تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمنع التلوث.</li>
	</ol></li></ol> 2. مما يجعل "اختيار دودة" <ol><li>قطع قطعة 1.5 سم من أسلاك الألومنيوم. عناية إدراج حوالي 0.5 سم طول هذا غيض من ماصة باستور.
	<ol><li>باستخدام موقد بنسن أو مصباح الكحول، تذوب نصيحة ماصة زجاجية بالتناوب ببطء في اللهب حتى الأسلاك بشكل أمن التقيد الماصة، دون المساس بالشكل الأصلي من طرف ماصة.</li>
	</ol></li></ol> 3. إعداد الثقافة كولاي <ol><li>باستخدام حلقة عقيمة، تطعيم مستعمرة واحدة من سلالة كولاي OP50 في 200 مل من "مرق لوريا". تبني بين عشية وضحاها مع الهز في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ثقافة السائل جاهز للاستخدام وفي اليوم التالي وقد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. 
	ملاحظة: يستخدم كمصدر لغذاء لسلالة كولاي، OP50، C. ايليجانس. ويمكن استخدام هذه الثقافة لتصل إلى عدة أشهر عند تخزينها في 4 ° C.</li>
</ol> 4. أساسي صيانة C. ايليجانس <ol><li>البذور التي أعدتها اكتشاف حوالي 50-100 ميليلتر استعداد الثقافة السائل OP50 في وسط اللوحة NGM أجار لوحات مع كولاي.</li>
	تغطي لوحات <li>والسماح لهم جاف في درجة حرارة الغرفة ح 24. بمجرد جفاف، وضع لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للنمو السريع أو تبقى في درجة حرارة الغرفة، إذا كان المطلوب هو نمو أبطأ.</li>
	<li>إضافة الديدان إلى اللوحة أما عن طريق &#34; chunking، &#34; (راجع الخطوة 5 من بروتوكول &#34; Chunking والديدان الانتقاء &#34;)، والتقاط الديدان منفردة، أو وضع بيض دودة مباشرة على اللوحة (راجع الخطوة 6 من بروتوكول &#34; "إعداد البيض" &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking والديدان الانتقاء ملاحظة: &#34; Chunking، &#34; يشير إلى ممارسة شائعة في صيانة C. ايليجانس. وهذا ينطوي على قطع مقطع من لوحة أجار NGM يحتوي على الديدان، ونقل هذه القطعة على لوحة جديدة، وهكذا أيضا نقل عدد كبير من الديدان في هذه العملية. كما قد يكون قطع التلوث خارج اللوحة بهذه الطريقة. عند اختيار الديدان، من المهم الحفاظ على سلامة أجار سبب الديدان يمكن أن تضيع في الثقوب في أجار. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم السماح لانتقاء لتبرد قبل لمس لوحة لمنع ذوبان في أجار أو حرق الديدان.
<ol><li>من أجل سرعة نقل كميات كبيرة من الديدان على لوحات جديدة، قطع قطعة من أجار NGM يحتوي على الديدان المحدد باستخدام ملعقة. إزالة قطعة قطعة ووضعه الوجه لأسفل على حافة حديقة OP50 على لوحة جديدة.</li>
	<li>نقل الديدان على حدة كما هو موضح أدناه في البروتوكول خطوة 8.2، &#34; "بقاء المقايسة"، &#34; استخدام دودة بيك. لهب الأسلاك في انتقاء دودة حتى يصبح أحمر. إزالته من اللهب، والسماح لها لتبرد لبضع ثوان.</li>
	<li>باستخدام الأسلاك على الانتقاء، بلطف كشط الحديقة لثقافة OP50 نمت على لوحة جديدة، تغطي الأسلاك في الانتقاء.</li>
	<li>ثقافة لزج تغطي غيض السلك يجعل الديدان عصا غيض الانتقاء، وهكذا بلطف التقاط الديدان المحدد باستخدام اقتراحا بالضرب-</li>
	<li>مرة واحدة جمعت الديدان مختارة، وضعها على لوحة جديدة بالضرب بلطف الثقافة عبر أجار. وضع الأسلاك في الشعلة لإزالة ثقافة المتبقية في الانتقاء.</li>
</ol> 6. بيضة التحضير <ol><li>بوضع حوالي 20 الحيوانات الكبار (حوالي 2-3 أيام بعد الفقس عندما تزرع في 20 درجة مئوية) أما الانتقاء أو chunking كما هو موضح في الخطوة 5، من البروتوكول &#34; Chunking والديدان الانتقاء، &#34; على طبق من ذهب المصنف مع 50 ميليلتر سلالة كولاي، OP50-</li>
	<li>لجمع البيض، والفيضانات اللوحة مع 10 مل من المخزن المؤقت M9 بعد 1-2 يوم. استخدام ماصة مصلية زجاج، دوامة وتحرض بلطف المحتويات على لوحة أجار للإفراج عن البيض تمسك OP50 أو الحيوانات الكبار. جمع جميع السائل الذي يحتوي على البيض والكبار-</li>
	أنبوب <li>الحل نقل M9 و OP50 إلى 15 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي 15 مل الأنبوبة المخروطية في 2,100 س ز للحد الأدنى 2</li>
	<li>نضح حوالي 9 مل من المادة طافية دون إزعاج بيليه OP50.</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه في 2 مل الماء المعقم ومل 1 من التبييض 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.25.</li>
	<li>المزيج بلطف بعكس حتى يبدو أن غالبية (نحو 70 في المائة) من الحيوانات الكبار ليسيد؛ عادة، البيض تبقى سليمة خلال هذا العلاج التبييض قصيرة بسبب قذيفة بهم. الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية في 990 س ز للحد الأدنى 2</li>
	<li>المادة طافية aspirate دون إزعاج بيليه. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من المخزن المؤقت M9.</li>
	<li>الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية في 990 س ز للمادة 2 دقيقة Aspirate طافية دون بيليه مثيرة للقلق. تعليق إعادة بيليه مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت M9. 
	ملاحظة: قد يتطلب إعداد البيض عدة محاكمات. وقد دمرت البيض إذا تعرضوا للتبييض لفترة طويلة جداً. إذا لم يفقس البيض، أما انخفاض تركيز التبييض في حل أو تقليل مدة التعرض للتبييض.</li>
</ol> 7. إنشاء لوحة العدوى <ol><li>الاستغناء عن 3-5 مل YPD في أنبوب اختبار عقيمة وتطعيم ذلك مع مستعمرة واحدة من المبيضات البيض استخدام حلقة عقيمة.
	<ol><li>وضع الأنبوب على طبل الدنمارك لما يقرب من 16-18 ح في 30 درجة مئوية.</li>
	</ol></li> <li>واحد تسمية 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على المبيضة، وأخرى تحتوي على OP50. تسجيل وزن كل أنبوبة فارغة.
	<ol><li>ميليلتر 500 مكان للمبيت الثقافة المبيضة في أنبوب المسمى المبيضة وميليلتر 1,500 ثقافة OP50 بين عشية وضحاها (من الخطوة 3.1) إلى الأنبوبة المسماة OP50.</li>
		<li>الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 16,100 س المادة زاي Aspirate طافية دون بيليه المزعجة.</li>
		<li>إعادة تعليق كل بيليه مع 500 ميليلتر من الماء المعقم. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16,100 غ. س</li>
		<li>المادة طافية aspirate دون إزعاج بيليه. تسجيل الوزن النهائي [ميكروفوج] أنابيب-</li>
		<li>تحديد وزن كل بيليه بطرح وزن الأولى [ميكروفوج] أنابيب من الوزن النهائي.</li>
	</ol></li> <li>باستخدام الماء المعقم، تعليق إعادة بيليه المبيضة إلى 10 ملغ/مل، وبيليه OP50 إلى 200 ملغ/مل. جعل عدوى رئيسي مزيج من خلال الجمع بين 10 ميليلتر من حل 50 ملغ/مل من ستربتوميسين، 2.5 ميليلتر لثقافة OP50، 0.5 ميليلتر للثقافة المبيضة و 7 ميليلتر من الماء المعقم.
	<ol><li>على لوحات التحكم، وخلق مزيج رئيسي بالاستعاضة عن حجم الثقافة المبيضة بالماء المعقم. البذور 20 ميليلتر ميكس العدوى أو حل OP50 السيطرة على لوحات مركز NGM باستخدام ميكروبيبيتي. 
		ملاحظة: الديدان حوالي 100 مطلوبة لتحديد الدلالة الإحصائية أثناء التحليل. عادة ما يتم تشغيل هذا الفحص في ثلاث نسخ. وهكذا، يرصد من 3.2 x ميكس العدوى وكذلك 3.2 x حل السيطرة. يمزج هذه مصنوعة لتكون يزيد قليلاً عن 3 × الأصلي لضمان أن ميليلتر الكامل 20 هو المصنف على كل لوحة، مما يتيح مجالاً للخطأ. يتم إنشاء هذا المزيج الرئيسي لأن البلعوم الدودة صغيرة جداً خلال المراحل الأولية اليرقات (L1 L3) تستهلك المبيضة. للتعرض للعوامل الدوائية مثل الفلوكونازول ( الشكل 3B)، هو عرض الوكيل إلى خليط العدوى. ويتحدد تجريبيا تركيز عامل. على سبيل المثال، في الشكل 3B، 50 ميكرومتر ويمثل الفلوكونازول، بيد أن 0 و 12.5، 25، 50 و 100 ميكرومتر الفلوكونازول كانت أيضا اختبار باستخدام البروتوكول نفسه.</li>
	</ol></li></ol> 8. تحليل النمط الظاهري "مشوه المنطقة الشرجية" (دار) والبقاء على قيد الحياة بالانزيم <ol><li>تصور النمط الظاهري دار ملاحظة: دار هو تصور أفضل في مرحلة المستوى 3 وما بعدها. دار يعرض نتوء صغير في منطقة الشرج وظيفة الدودة ( الشكل 2A)، الذي يصبح أكثر وضوحاً مع مرور الوقت.
	<ol><li>تأكيد إذا كان حيوان قد دار بسرعة النقر على اللوحة في مرحلة مجهر تشريح؛ والحيوانات دون إرادة دار الانتقال على الفور إلى الوراء، بينما الحيوانات مع دار سوف تحتاج أما تكرار جولات التنصت عكس اتجاهها، أو أنهم لن تفعل ذلك على الإطلاق-</li>
	</ol></li> <li>البقاء على قيد الحياة بالانزيم <ol><li>إعداد البيض كاملة كما سبق ذكره في البروتوكول الخطوة 6، &#34; "إعداد البيض" &#34;. عد البيض ضمن نطاق التشريح، وتمييع الحل البيض مع M9 حتى يتحقق بتركيز حوالي 5-6 بيضة صحية في ميليلتر. استخدام ماصة، الاستغناء عن 20 ميليلتر عينة تحتوي على حوالي 30 البيض على استعداد NGM لوح، في المنطقة الواقعة بين ثقافة البكتيرية والجانب من لوحة (البيض والأغذية دودة، OP50، في المكانين متميزة)-</li>
		<li>لوحات إينكوباتي في 20 درجة مئوية ح 48. تحت مجهر تشريح، عد عدد الديدان الحية وقتل الكبار في كل لوحة، وكذلك العدد من الديدان مع دار. سجل المئة مع دار.</li>
		<li>النظر في حيوان الميت إذا لم يستجب يجري استغلالها على رأسه بأسلاك الألومنيوم أو التنصت على اللوحة-</li>
		<li>كل يوم، نقل الديدان الكبار المتبقية بالانتقاء كما هو موضح في الخطوة 5، من البروتوكول &#34; Chunking والديدان الانتقاء، &#34; على لوحة العدوى أو عنصر التحكم جديد. عند هذه النقطة، إذا لزم الأمر، القيام مقايسة البقاء على قيد الحياة بتعقب عدد الديدان حية والقتلى والمفقودين كل يوم- 
		ملاحظة: قد يعمل هذا التحليل لمدة أسبوعين، ابتداء من إعداد البيض. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن الاستغناء الحل البيض على ثقافة البكتيرية، كما أن الحل قد تحتوي على آثار التبييض التي يمكن أن تقتل في OP50. كما ينبغي أن يكون الحل الاستغناء عن حوالي 0.5 سم بعيداً عن حافة اللوحة، كما أن البيض يمكن أن تصبح عالقاً بين جانبي اللوحة واجار. بالإضافة إلى ذلك، نظراً للانتشار السريع للديدان، نقل الكبار على لوحات جديدة أمر بالغ الأهمية لفصلها عن ذريتهم.</li>
	</ol></li> <li>بقاء تحليل <ol><li>تحليل النتائج باستخدام برمجيات تحليل منحنى البقاء على قيد الحياة (الرجوع إلى قائمة المواد)-</li>
		<li>بقاء مقارنة منحنيات باستخدام الأسلوب Grehan-بريسلو-الرتبي (مع افتراض أن البيانات من أوقات مبكرة من البقاء على قيد الحياة أكثر دقة من أوقات لاحقة، وزن البيانات تبعاً لذلك) فضلا عن الأدوات الإحصائية لوجرانك 45- 
		ملاحظة: على سبيل المثال، في الشكل 4 باء -ج، بقاء الديدان تعامل مع المسخ المبيضة هو مقارنة بتلك التي تعامل مع عناصر التحكم البرية من نوع اسوي أو كومبليمينتاريستراينس-</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يمكن تعديل طرق المعايرة C. ايليجانس العدوى والبقاء على قيد الحياة على مدى التعرض مدى الحياة المبيضة التي وصفناها لاختبار آخر الممرض. قد السائل ثقافات أخرى من البكتيريا أو الفطريات وتتغذى على C. ايليجانس بطريقة مماثلة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون جزيئي التهابات المسلسل بتعريض ا...

C. ايليجانس قد استخدمت ككائن نموذج قوية لأكثر من 50 عاماً. وفي الستينات، رائدة الأحياء جنوب أفريقيا سيدني برينر استخدام C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا العصبية، يمهد الطريق لنسب طويلة من العلماء لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلية والحيوان في الديدان الخيطية. وتشمل هذه النسب الحائزين على جائزة نوبل كريغ ميلو وأندرو النار على العمل [رني]1وروبرت هورفيتز وجون سالستون للعمل على تطوير الجهاز والمبرمج2،،من34، ومارتن تشالفي لعمله على بروتين فلوري أخضر5. على الرغم من أن هذا الكائن الحي النموذجي قد استخدمت تقليديا لدراسة البيولوجيا الجزيئية والإنمائية، على مدى السنوات ال 15 الماضية، بدأ الباحثون استخدام C. ايليجانس للتحقيق بيولوجيا مختلف مسببات الأمراض البشرية بما في ذلك Pseudomonas الزّنجاريّة، انتيريكا السالمونيلا، المكوّرات العنقودية الذهبيةو marcescens السراتية6،،من78،9،10. وكشفت هذه الدراسات أن العديد من الآليات التي تشارك في التفاعل الإنسان-الممرض هي المحافظة في الديدان الخيطية، ولكن أيضا أن هناك بعض آليات الحصانة التي فريدة من نوعها لهذا النموذج الحي11،12. في الطبيعة، C. ايليجانس لقاءات مجموعة متنوعة من التهديدات من مسببات الأمراض المستهلكة الموجودة في التربة، ووفر هذا ضغط انتقائي قوية في التطور والحفاظ على نظام المناعة فطرية متطورة في التجويف المعوي،. العديد من الجينات والآليات التي تشارك في حماية التجويف المعوي هي مدبرة من قبل العناصر المحافظة جداً التي توجد أيضا في11،الثدييات العليا13. ولذلك يمثل C. ايليجانس نموذج عظيم لدراسة مسببات الأمراض المعدية المعوية مثل السالمونيلا انتيريكا14أو15من بويديي دوسنتاريا ضمه الكوليرا16.
هنا نسلط الضوء على براعة ملحوظة في C. ايليجانس كمضيف نموذج لدراسة العوامل المعدية مثل المبيضة. C. ايليجانس كمضيف نموذج يسمح لفحص إنتاجية عالية لضراوة التي أقل تكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً من نموذج الفأر، الذي يستخدم عادة لدراسة داء المبيضات42.
في هذه الدراسة، تبين لنا أن هذا النموذج ومقايسة البقاء على قيد الحياة أسوسياتيد يمكن موثوق بها لدراسة المضيف المستجيبة المناعة الفطرية الهامة لمكافحة العدوى، والمحددات الخاصة بالعوامل الممرضة التي تدفع بضراوة، والمركبات الدوائية التي يمكن أن أن تتدخل في نشوء المرض. تختلف عن الاختبارات الموصوفة سابقا، هذا الأسلوب يوفر وسيلة لدراسة التعرض للعوامل الممرضة على مدى فترة عمر الحيوان، من مرحلة اليرقات إلى مرحلة البلوغ، بدلاً من فقط سن البلوغ إلى وفاة43،44. وباختصار، لدينا C. ايليجانس -نموذج المبيضة هو أداة قوية وتنوعاً التي يمكن استخدامها ليس فقط لدراسة الأسس الوراثية التي تقود العدوى والحصانة ولكن أيضا لتحديد مركبات جديدة للتدخل العلاجي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

علينا أن نظهر أسلوب استخدام ايليجانس كاينورهابديتيس كمضيف نموذج لدراسة التفاعل الميكروبية. ويتم إدخال الميكروبات عن طريق النظام الغذائي يجعل الأمعاء الموقع الرئيسي للمرض. الأمعاء السلكية هيكلياً ووظيفيا يقلد أمعاء الثدييات وهو شفاف يجعلها قابلة للدراسة المجهرية للاستعمار. هنا نظهر أن مسببات الأمراض يمكن أن تسبب المرض والموت. نحن قادرون على تحديد طفرات الميكروبية التي تظهر ضراوة غيرت. يجعل استجابتها الفطرية المصانة الإجهادات الأحيائية C. ايليجانس نظاما ممتازا للتحقيق في أوجه التفاعلات المناعية الفطرية المضيف. نظهر أن تستضيف مع الطفرات في الجين أوكسيديز المزدوج لا يمكن أن تنتج الأنواع الأكسجين التفاعلية وغير قادر على مقاومة الميكروبات إهانة. كذلك ندلل على براعة المقايسة بقاء قدم بإظهار أنه يمكن استخدامه لدراسة تأثيرات مثبطات لنمو الميكروبات. كما يمكن استخدام هذا الفحص اكتشاف عوامل الفوعة الفطرية كأهداف لتطوير العوامل المضادة للفطور الرواية، فضلا عن إتاحة فرصة لمواصلة الكشف عن التفاعلات بين الميكروبات والمضيف. تصميم هذا التحليل يفسح المجال أيضا لإنتاجية عالية شاشات كل الجينوم، بينما القدرة على الديدان cryo-المحافظة لاستخدامها في المستقبل يجعل من نموذج حيوان كله جذابة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة.

قد سبق وصف المرضية مقايسة (الشكل 1) استخدام المبيضة و C. ايليجانس لدينا مختبر17،18 و19،مختبرات أخرى20. نبدي الانقياد لاستخدام C. ايليجانس لدراسة الفوعة المبيضة تبين أن الخلايا ...

Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.2K Views.  Worcester Polytechnic Institute. نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

Video: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

الثقافة و المقايسة من السكان على نطاق واسع Caenorhabditis النخبوية المختلطة

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...