مطاردة النبض المشع باستخدام 35 S المسمى الميثيونين والسيستين لا يزال الأساليب الكيميائية الحيوية الوحيدة للتحقيق في التركيب الحيوي البروتين مع الوقت في الخلايا الحية. ويشمل التركيب الحيوي للبروتين كلا من الترجمة والطية والتجميع والاتجار والتدهور. الجمع بين مطاردة النبض المشع مع تحليل التعديلات البروتينية المشتركة واللاحقة للترجمة ، مثل تكوين سندات التكفيريد والأسيتيل يوفر مقايسة حساسة وكمية للتحقيق في إيمان البروتين مع مرور الوقت.
مطلوب التركيز الجيد والتعامل التجريبي لهذا الإجراء. إعداد جيد أمر بالغ الأهمية، مثل المخازن المؤقتة، مساحة العمل المشعة الخاصة بك، وجدول زمني واضح. هذا الفيديو يوفر واضحة على عرض الكتف من بروتوكول مطاردة النبض المشع.
إثبات الإجراء سيكون هوي يينغ يوه، مرشح pHd من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، transfect البذور والخلايا الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل مطاردة النبض، افحص خلاياك من خلال المجهر.
بعد ذلك، اغسل الأطباق بمليلترين من عازل الغسيل. و مليلتران من التجويع وسط الخلايا ووضع الأطباق في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. تأكد من أن إعداد مطاردة النبض الخاص بك هو في النظام.
نقل الأطباق إلى الرفوف في حمام الماء، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية. تأكد من أن الأطباق على اتصال مع الماء، ولكن لا تطفو. ثم، بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
في 40 ثانية، استلهمي وسط المجاعة. باستخدام الأنابيب الصغيرة، ووضع ما يصل 600 ميكرولترات من حل النبض. في دقيقة واحدة بالضبط، إضافة بلطف حل نبض إلى وسط الطبق.
كرر هذه العملية لإزالة وسط المجاعة وإضافة حل النبض للأطباق المتبقية على فترات دقيقة واحدة. في بالضبط 11 دقيقة ولجميع الأطباق التالية، وفقا لمخطط مطاردة النبض، باستثناء عينة مطاردة دقيقة الصفر، إضافة ملليلتر اثنين من مطاردة المتوسطة مباشرة إلى الطبق. التعرق متوسطة مطاردة واستبدالها مع ملليلتر اثنين من وسط مطاردة جديدة.
كرر هذه العملية لجميع الأطباق المتبقية على فترات دقيقة واحدة. عندما يقرأ جهاز ضبط الوقت بالضبط 16 دقيقة، إضافة اثنين من militers من مطاردة المتوسطة مباشرة إلى طبق مطاردة دقيقة الصفر، على رأس وسيط نبض، لوقف وضع العلامات. على الفور التعرق المتوسطة.
نقل الطبق إلى لوحة الألومنيوم المبردة وإضافة اثنين من militers الجليد الباردة وقف العازلة. نقل جميع الأطباق الأخرى إلى حاضنة في 37 درجة مئوية. نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى من الحاضنة إلى حمام الماء قبل دقيقتين من نهاية كل وقت مطاردة.
في الوقت مطاردة الدقيق لكل طبق، التعرق متوسطة مطاردة ونقل الطبق إلى لوحة الألومنيوم المبردة. إضافة ملليلتر اثنين من الجليد الباردة توقف العازلة. ترك جميع الأطباق على الجليد والتوقف عن العازلة حتى يكون هناك وقت لlyse الخلايا.
ثم التعرق في حل التوقف وغسل جميع الأطباق. ثلاثة في نفس الوقت مع مليلترين من الجليد الباردة وقف الحل. التعرق وقف الحل تماما وإضافة 600 ميكرولترات من عازلة تحلل إلى طبقين في وقت.
باستخدام مكشطة الخلية، كشط سطح الطبق بدقة، ولكن بلطف لخلط lysate. نقل lysate من كل طبق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير. جهاز طرد مركزي في 15، 000 إلى 20، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه النوى.
لمطاردة النبض على الخلايا المعلقة جمع خمسة ملايين خلية في نقطة الوقت في أنبوب واحد 50 ملليلتر. تنفيذ إجراء starvation كما هو موضح في النص. بعد إجراء المجاعة في حمام الماء لمدة 15 دقيقة ، ابدأ المؤقت.
في دقيقة واحدة بالضبط، إضافة 275 microcuries من تسمية غير مخفف مباشرة إلى أنبوب تحتوي على الخلايا ودوامة لخلط. في دقيقة 11 بالضبط، إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام مطاردة لوقف وضع العلامات. ونقل على الفور ملليلتر واحد إلى أنبوب 15 ملليلتر على الجليد الذي يحتوي على تسعة ملليلتر من الجليد الباردة وقف حل لوقف وضع العلامات.
كرر هذه العملية لنقل ملليلتر واحد من مطاردة إلى أنبوب على الجليد تحتوي على تسعة ملليلتر من وقف الحل لكل نقطة وقت مطاردة المتعاقبة. بعد الاعتياز, يتبخر الغسل الأخير تماما. إعادة تعليق الخرز في 20 ميكروليتر من العازلة وTE دوامة.
إضافة 20 ميكروليتر من اثنين X عينة العازلة دون وكيل الحد. دوامة العينات ثم تسخينها في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. دوامة العينات مرة أخرى.
جهاز طرد مركزي في 12،000 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. نقل 19 ميكرولترات من غير مخفضة سوبرات إلى أنبوب جديد microcentuge التي تحتوي على ميكرولتر واحد من 500 ملليمولار دي تي. إذا لزم الأمر، الطرد المركزي العينة بسرعة بحيث جميع السوائل في الجزء السفلي.
وتسخن على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق السماح للعينة المخفضة تبرد ثم تبرد دوامة. أجهزة الطرد المركزي على حد سواء خفضت وغير خفضت العينات في 12، 000 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة، ثم إضافة 1.1 ميكرولترات من واحد NEM الضرس لجميع العينات.
في هذه الدراسة، يتم استخدام نهج مطاردة النبض المشع لتحليل طي البروتين ونقله في الخلايا السليمة. يظهر طي وإفراز فيروس نقص المناعة البشرية واحد GP120 من مطاردة نبض معتنقي هنا. يُظهر الجل غير المتناقص الطي التأديدي لـ GP120.
مباشرة بعد وضع العلامات النبض، يبدو كما الفرقة منتشر أعلى في هلام. كما تقدم مطاردة، والفرقة يهاجر أسفل هلام من خلال وسيطة قابلة للطي أكثر انتشارا حتى تتراكم في الفرقة الضيقة التي تمثل مطوية أصلا في GP120. يحدث هذا مع زيادة تكوين روابط ثاني كبريتيد في ضغط البروتين، مما يؤدي إلى هجرة أسرع من البروتين المخفض بالكامل.
على الحد من هلام، وقد تم تخفيض الروابط كبريتيد وجميع الجزيئات ولا تؤثر على mobiilty. وعلى هذا النحو، فإن الاختلافات في القدرة على الحركة ليست سوى نتيجة للتغيرات في الكتلة الجزيئية. يمثل التحول بمرور الوقت من شكل الببتيد المُقلل إلى شكل الببتيد المشقوق للإشارة المشقوقة شكل الببتيد بعد النقل من GP120.
يزيد التنقل بسبب فقدان الببتيد إشارة الذي يزيد أثناء المطاردة كما المزيد من البروتينات تحقيق أضعاف الأصلي وتفقد الببتيد إشارة بهم. على كل من هلام غير خفض والحد، تبدأ إشارة في الانخفاض من ساعة واحدة تقريبا فصاعدا بسبب إفراز GP120. ويمكن رصد ذلك من خلال تحليل وسائل الإعلام.
هذه الطريقة قابلة للتطبيق على أي خط الخلية، بما في ذلك نماذج الخلايا العضوية. غير أنّ يعتمد النجاح كثيرا على التعبير مستوى من البروتين الفائدة. قبل البدء في هذا الإجراء، ضع علامة على الأطباق الخاصة بك والحفاظ على هذا النظام طوال التجربة.
تأكد من أن كل شيء جاهز قبل إضافة وسط المجاعة. هذه بداية التجربة ووقت مختبرك هو صديقك، ولكن يمكن أن يكون أكبر عدو لك عندما كنت غير مستعدة.
يمكن الجمع بين مطاردة بيل مع تحلل البروتين المحدود للتحقيق في الحوزة الكاملة للبروتينات مع مرور الوقت. أيضا مختلف أساليب التجميد المنتخبة سوف تسمح بتحليل شطف أو صرامة أو الخلافات تهمة. لحماية الباحث والجهاز، يجب أن تُطاع جميع قواعد السلامة الإشعاعية المحلية.
وينبغي اتخاذ تدابير وقائية وفقا للبروتوكول. لاحظ أن الأكريلاميد الخاص بك، وتستخدم لصفحة STH الخاص بك هو سُمّي عصبي.
