باتباع هذا البروتوكول، فإن المستخدم تكون قادرة على إنتاج ناقلات AAV من النقاء العالية وغلة مناسبة للتطبيقات في المختبر أو في الجسم الحي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج وتنقية مجموعة من الأنماط المصلية AAV مع الاختلافات في التكوينات. يمكن الجمع بين هذين العنصرين يكون مفيداً للحصول على نوع الخلية والتعبير الخاص بالأنسجة.
إنتاج بعض الأنماط المصلية يمكن أن تعطي لانخفاض العائد. هذا هو الإنتاج حيث توجد أنماط المصل قريبة وينبغي تقييمها على أساس فردي. إثبات هذه الإجراءات ستكون شيلي فريبونت، فني من مختبرنا.
بعد زراعة خلايا HEK ، اخلط 360 ميكروغرامًا من plasmid المساعد ، و 180 ميكروغرامًا من البلازميد ترميز الفلفل المتجه ، و 180 ميكروغرامًا من البلازميد تحتوي على ترانسجين في 18 ملليلتر من كلوريد الصوديوم 150 ملليمولار لإعداد مزيج الحمض النووي. توزيع هذا المزيج على ثلاثة 50 ملليلتر أنابيب المخروطية. في أنبوب مخروطي جديد، اخلط 840 ميكروغرام من جزيرة الأمير إدوارد وستة ملليلترات من كلوريد الصوديوم 150 ملليمولر لإعداد مزيج PEI لستة أطباق ثقافة الخلايا.
ثم، إضافة ستة ملليلتر من مزيج PEI، قطرة قطرة، إلى واحدة من الأنابيب المخروطية التي تحتوي على مزيج الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة ستة أطباق ثقافة الخلايا من الحاضنة.
في غطاء محرك التدفق صفح، pirate تماما المتوسطة من كل طبق. شطف الأطباق مع خمسة ملليلتر من DPBS ساخنة قبل لإزالة آثار المتوسطة. إمالة بلطف كل طبق لضمان DPBS موزعة بالتساوي على السطح بأكمله.
ثم، تعرق بلطف DPBS. أضف 12 ملليلتر من DMEM واحد إلى كل طبق ببطء ، مع ماصة توضع على حافة الطبق. اخلطي خليط PEI والحمض النووي عن طريق الخفقان لأعلى ولون ثلاث إلى خمس مرات.
إضافة ملليلترين من هذا الخليط إلى كل من الأطباق ثقافة الخلية الستة في قطرة عن طريق الأزياء قطرة، مع التأكد من توزيع بعناية على السطح بأكمله. كرر هذه العملية باستخدام ستة أطباق ثقافة الخلية في وقت حتى تصل إلى 18 طبق ثقافة الخلية. هز بلطف أطباق زراعة الخلايا لتوزيع خليط الحمض النووي PEI.
احتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية مع رطوبة 95 في المئة و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. بعد هذا، إضافة 12 ملليلتر إضافية من DMEM 10 إلى كل من الأطباق 18 دون إزالة المتوسطة الموجودة مسبقا. مواصلة احتضان الخلايا المُصابة بالعدوى في نفس الظروف.
في 72 ساعة بعد نقل، واستخدام مكشطة الخلية لفصل بعناية الخلايا من كل طبق الثقافة. جمع المتوسطة وخلايا اثنين من أطباق الثقافة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وأبقى على الجليد. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 420 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق مع تسارع وتباطؤ جهاز الطرد المركزي تعيين إلى أقصى حد.
تجاهل بعناية المابير من كل أنبوب عن طريق صب بلطف في حاوية التخلص من النفايات. ثم، ضع الأنابيب التي تحتوي على كريات الخلية على الجليد. نحن نعلق كل بيليه في ملليلتر اثنين من العازلة تحلل ومزيج عن طريق pipetting صعودا وهبوطا من خمس إلى 10 مرات.
سحب AAV من ثلاثة أنابيب، معا. للبدء ، تجميد الخلايا التي أعيد تعليقها عن طريق وضعها في دلو يحتوي على الجليد الجاف الممزوج بالإيثانول. ثم ذاب الخلايا عن طريق وضعها على الفور في حمام مائي تعيين في 37 درجة مئوية.
كرر هذا التجميد وذوبان دورة ثلاث مرات لlyse الخلايا والإفراج عن جزيئات AAV. وبعد خطوة الذوبان الثالثة، بلغ عدد أجهزة الطرد المركزي 1167 مرة في G، وبأربعون درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل بعناية سراويل لتنظيف أنابيب مخروطية 50 ملليلتر.
إضافة النوى إلى كل أنبوب إلى تركيز النهائي من 50 وحدة لكل ملليلتر من افر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، في حين يحوم الأنابيب كل 10 دقائق لضمان أن يتم خلط النوى تماما مع المابير. أجهزة الطرد المركزي في 13490 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتوضيح فائقة.
بعد هذا، إزالة المكبس من حقنة 10 ملليلتر، إرفاق مرشح ميكرومتر 0.45 إلى الحقنة ووضعها على رأس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر نظيفة. ملء بعناية حقنة مع اضحة فائقة. استخدام المكبس لفرض lysate من خلال عامل التصفية.
بعد ذلك، قم بإعداد كل جزء من كسور الوديكسول في أربعة أنابيب مخروطية منفصلة 50 ملليلتر، كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص. Pipette ثمانية ملليلتر من 15 في المئة iodixanol في كل من الأنابيب الثلاثة فائقة التركيز. Pipette 5.5 ملليلتر من 25 في المئة iodixanol في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر نظيفة.
باستخدام ماصة باستور غير المتخرجة، طبقة بعناية 5.5 ملليلتر من 25 في المئة حل iodixanol تحت محلول iodixanol 15 في المئة. إضافة حلول 40 بالمائة و 60 بالمائة كما هو موضح في بروتوكول النص. وينبغي أن كسور Iodixanol لا تتشابك على طبقات.
باستخدام ماصة باستور، طبقة lysate الخام على رأس 15 في المئة iodixanol الانحدار، قطرة قطرة، لتجنب إزعاج الواجهة بين lysate الخام وحل iodixanol. ملء كل أنبوب الطارد فائقة مع عازلة التحلل حتى الغضروف المفصلي يصل إلى قاعدة الرقبة أنبوب، لضمان أنبوب لا تنهار تحت القوى العالية جدا ولدت أثناء الطاردة المفرطة. أغلق الأنابيب باستخدام الأغطية المناسبة.
باستخدام مقياس رقمي، تأكد من أن جميع أنابيب الطرد الفائق التركيز الثلاثة لها نفس الوزن. ضبط الوزن حسب الضرورة، عن طريق إضافة المزيد من العازلة تحلل على رأس lysate الخام. استخدام زاوية ثابتة التيتانيوم الدوار إلى الطرد المركزي الأنابيب في 301580 مرات G و 12 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة و 40 دقيقة باستخدام أقصى تسارع والتباطؤ.
بعد ذلك، قم بتوصيل إبرة بحقنة خمسة ملليلتر. إزالة المسافة من الأنابيب في الدوار، واستعادة الأنابيب بعد الطرد المركزي. التعرق فقط 40 في المئة iodixanol كسر الذي يحتوي على جزيئات ناقلات.
إما معالجة العينة أو تخزينها عند أربع درجات مئوية. هنا، يتم إثبات بروتوكول يمكن استخدامه لإنتاج ناقلات AAV مع مجموعة متنوعة من الفلفلات، وتكوينات الجينوم، وأنواع المروج، والبضائع transgene. في هذا المثال، أنتجنا وطهرنا ناقلين مختلفين من AAV عبّر عن البروتين الفلوري الأخضر من جينوم ذاتي مجاني.
وتتميز ناقلات اثنين من قبل capsids مختلفة: PHPB وAV9. تم تسليمها، عن طريق حقن الوريد الذيل، إلى الفئران الستة السوداء البالغة C57. لتقييم مستويات التعبير عبر جيني ثلاثة أسابيع بعد الحقن، وتلطخت المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية ضد GFP مع الكشف عن استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى صبغة الفلورسنت.
قياسات كثافة الفلوريسنس تظهر زيادة كبيرة في تعبير GFP عند استخدام متجه PHPB نسبة إلى AAV9. ولوحظت زيادات في GFP في المخ، المخيخ، وفي جذع الدماغ. جمع دقيق من ناقلات تحتوي على كسر أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول.
في حالة عدم القيام بذلك بشكل صحيح، تتأثر بشكل سلبي العائد المتجه وكذلك نقاء المتجه. كونها قادرة على إنتاج ناقلات AAV، مختبرات صغيرة ستكون في وضع يمكنها من الاستفادة من العديد من الاحتمالات التجريبية لتقديم الجينات في الجهاز العصبي المركزي. يتطلب هذا البروتوكول استخدام الطرد الفائق التركيز ومن المهم الحصول على التدريب المناسب قبل التعامل مع هذا من أجل تجنب الحوادث.
وعلاوة على ذلك، غالبا ما تصنف ناقلات AAV على أنها تشكل مهاجزات بيولوجية، ولذلك، يجب عليك الرجوع إلى اللوائح المحلية قبل التعامل معها وإدارتها.
