このプロトコルに従うことによって、ユーザは高純度のAAVベクターを産生し、インビトロまたはインビボ用途に適した収量を得ることができる。このプロトコルは、構成の違いを持つAAV血清型の範囲を製造し、精製するために使用することができます。これら2つの元素を組み合わせることは、細胞型および組織特異的発現を得るのに有用であり得る。
いくつかの血清型の生産は、低収率を与えることができます。これは、密接な血清型があり、個々に評価されるべき生産です。これらの手順を実証することは、私たちの研究室の技術者シェリー・フリポンです。
HEK細胞を増殖した後、ヘルパープラスミドの360マイクログラム、ベクターカプシドをコードするプラスミドの180マイクログラム、および150ミリモル塩化ナトリウムの18ミリリットルでトランスジーンを含むプラスミドの180マイクログラムを混合し、DNA混合物を調製する。このミックスを3本の50ミリリットル円錐形チューブに分配します。新しい円錐形チューブで、840マイクログラムのPEIと150ミリモル塩化ナトリウム6ミリリットルを混合し、6つの細胞培養皿用のPEIミックスを準備します。
次に、6ミリリットルのPEIミックスを加え、滴下して、DNAミックスを含む円錐管の1つに滴下する。室温で20分間インキュベートします。次に、培養器から6種類の細胞培養皿を取り除きます。
層流フードで、各皿から培地を完全に吸引する。5ミリリットルのあらかじめ温めたDPBSで皿をすすいで、培地の痕跡を取り除く。各皿を軽く傾けて、DPBSが表面全体に均等に分散するようにします。
その後、DPBSを軽く吸引する。12ミリリットルのDMEMを各皿にゆっくりと加え、ピペットを皿の端に置きます。PEIとDNA混合物を上下に3〜5回ピペットして混ぜます。
6つの細胞培養皿のそれぞれにこの混合物の2ミリリットルをドロップして追加し、慎重に表面全体に配布することを確認します。18個の細胞培養皿に到達するまで、一度に6つの細胞培養皿を使用してこのプロセスを繰り返します。細胞培養皿を軽く振ってPEI DNA混合物を分配する。
トランスフェクトした細胞を湿度95%、炭酸ガス5%で摂氏37度で5時間インキュベートします。この後、既存の培地を取り除くことなく、18個の各ディッシュに12ミリリットルのDMEM 10を追加します。同じ条件でトランスフェクトされた細胞をインキュベートし続けます。
トランスフェクション後72時間で、細胞スクレーパーを使用して、各培養皿から慎重に細胞を取り外します。培地と2つの培養皿の細胞を15ミリリットルの円錐管に集め、氷の上に保管します。チューブを420倍G、摂氏4度で10分間遠心分離し、遠心分離機の加速と減速を最大に設定します。
各チューブから上清を丁寧に廃棄し、廃棄容器にそっと注ぎます。次に、細胞ペレットを含むチューブを氷の上に置きます。各ペレットを2ミリリットルのリシスバッファーに吊り下げ、5~10回上下にピペットで混合します。
3本のチューブからAAVを引き出します。まず、再懸濁した細胞をエタノールと混合したドライアイスを含むバケツに入れて凍結します。その後、すぐに摂氏37度に設定された水浴に入れて細胞を解凍します。
この凍結と解凍サイクルを3回繰り返して細胞を融解し、AAV粒子を放出します。第3の解凍ステップの後、1167倍Gで遠心分離機、15分間摂氏4度で。慎重に50ミリリットルの円錐管をきれいにするために上清を移します。
各チューブにヌクレアーゼを加えて、上清のミリリットル当たり50単位の最終濃度にします。37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとにチューブを渦巻きさせ、ヌクレアーゼが上清と完全に混合されるようにします。上清を明確にするために13490倍Gで、摂氏4度で20分間遠心分離機。
この後、10ミリリットルのシリンジのプランジャーを取り外し、0.45マイクロメートルのフィルターをシリンジに取り付け、清潔な50ミリリットル円錐形チューブの上に置きます。慎重に明確化した上清で注射器を充填します。プランジャーを使用して、フィルターを通してライセートを強制します。
次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、4つの別々の50ミリリットル円錐管に各iodiキサノール画分を調製する。ピペット8ミリリットルの15%のイオジキサノールを3つの超遠心チューブのそれぞれに入れた。ピペット5.5ミリリットルの25%のイオジキサノールを清潔な50ミリリットルの円錐管に入れた。
非卒業パスツールピペットを使用して、慎重に15%のiodiキサノール溶液の下に25%のiodiキサノール溶液の5.5ミリリットルを重ね。テキスト プロトコルで説明されているように、40% と 60% のソリューションを追加します。イオジキサノール画分は、層状に混ぜてはならない。
パスツールピペットを使用して、粗溶解液とイオジキサノール溶液との界面を乱さないように、15%のiodiキサノール勾配の上に粗溶解物を重ね、滴下して落とす。半月板がチューブネックの基部に到達するまで、各超遠心チューブにリシスバッファーを充填し、超遠心分離中に発生する非常に高い力でチューブが崩壊しないようにします。適切な蓋を使用してチューブを閉じます。
デジタルスケールを使用して、3つの超遠心チューブがすべて同じ重量を持っていることを確認してください。必要に応じて重量を調整し、粗リセートの上にさらにリシスバッファーを加える。固定角度のチタンローターを使用して、最大加速度と減速を使用して、301580倍Gでチューブを遠心分離し、摂氏12度で1時間40分間使用します。
次に、5ミリリットルの注射器に針を取り付けます。ローターのチューブからスペーサーを取り出し、遠心分離後にチューブを回収します。ベクター粒子を含む40%のイオジキサノール画分のみを吸引する。
サンプルを処理するか、摂氏4度で保存します。ここで、様々なキャプシド、ゲノム構成、プロモータータイプ、およびトランスジーン貨物を用いてAAVベクターを産生することができるプロトコルが実証される。この例では、自己の無料ゲノムから緑色蛍光タンパク質を発現する2つの異なるAAVベクターを製造および精製しました。
2 つのベクトルは、PHPB と AAV9 という異なるキャプシドによって区別されます。彼らは尾静脈注射を介して、成体C57黒6匹のマウスに送達された。注射後3週間で遺伝子導入発現のレベルを評価するために、切片は蛍光色素に結合した二次抗体を用いた検出を用いてGFPに対する一次抗体で染色される。
蛍光強度測定では、AAV9に対してPHPBベクターを使用した場合のGFP発現の有意な増加を示す。GFPの増加は、大脳、小脳、および脳幹で観察された。このプロトコルでは、分数を含むベクトルの正確なコレクションが重要です。
これが適切に行われていない場合、ベクターの収率とベクターの純度が悪影響を受けます。AAVベクターを産生することができるので、小さな実験室は中枢神経系に遺伝子を送達するために多くの実験的可能性を利用する立場にあるでしょう。このプロトコルは、超遠心分離機の使用を必要とし、事故を避けるために、これを処理する前に適切な訓練を受けることが重要です。
さらに、AAVベクターはバイオハザードに分類されることが多いため、それらを取り扱い管理する前に現地の規制を参照する必要があります。
