Seguindo este protocolo, o usuário poderá produzir vetores AAV de alta pureza e rendimento adequado para aplicações in vitro ou in vivo. Este protocolo pode ser usado para produzir e purificar uma gama de sorotipos AAV com diferenças nas configurações. A combinação desses dois elementos pode ser útil para obter o tipo celular e a expressão específica do tecido.
A produção de alguns sorotipos pode dar um rendimento menor. Esta é a produção onde há sorotipos próximos e deve ser avaliado individualmente. Demonstrando esses procedimentos será Shelly Fripont, técnica do nosso laboratório.
Depois de cultivar as células HEK, misture 360 microgramas de plasmídeos auxiliares, 180 microgramas de plasmid codificando o capsídeo vetorial, e 180 microgramas de plasmídeo contendo o transgene em 18 mililitros de 150 milimilas de cloreto de sódio para preparar a mistura de DNA. Distribua esta mistura por três tubos cônicos de 50 mililitros. Em um novo tubo cônico, misture 840 microgramas de PEI e seis mililitros de cloreto de sódio de 150 mililitros para preparar a mistura pei para seis pratos de cultura celular.
Em seguida, adicione seis mililitros da mistura PEI, gota a gota, a um dos tubos cônicos contendo a mistura de DNA. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova seis pratos de cultura celular da incubadora.
Em uma capa de fluxo laminar, aspire completamente o meio de cada prato. Enxágüe os pratos com cinco mililitros de DPBS pré-aquecidos para remover traços do meio. Incline suavemente cada prato para garantir que o DPBS seja distribuído uniformemente por toda a superfície.
Em seguida, aspire suavemente o DPBS. Adicione 12 mililitros de DMEM um a cada prato lentamente, com uma pipeta colocada na borda do prato. Misture o PEI e a mistura de DNA, encanar-o para cima e para baixo três a cinco vezes.
Adicione dois mililitros desta mistura a cada um dos seis pratos de cultura celular de forma gota a gota, certificando-se de distribuí-lo cuidadosamente sobre toda a superfície. Repita este processo usando seis pratos de cultura celular de cada vez até chegar a 18 pratos de cultura celular. Agite suavemente os pratos da cultura celular para distribuir a mistura de DNA PEI.
Incubar as células transfeinadas a 37 graus Celsius com 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois disso, adicione mais 12 mililitros de DMEM 10 a cada um dos 18 pratos sem remover o meio pré-existente. Continue incubando as células transfeinadas nas mesmas condições.
Às 72 horas após a transfecção, use um raspador de células para separar cuidadosamente as células de cada prato de cultura. Colete o meio e as células de dois pratos de cultura em um tubo cônico de 15 mililitros, mantidos no gelo. Centrifugar os tubos a 420 vezes G e a quatro graus Celsius por 10 minutos com a aceleração e desaceleração da centrífuga definida ao máximo.
Descarte cuidadosamente o supernatante de cada tubo, despejando-o suavemente em um recipiente de descarte de resíduos. Em seguida, coloque os tubos contendo as pelotas de célula no gelo. Suspendemos cada pelota em dois mililitros de tampão de lise e misturamos pipetting para cima e para baixo cinco a dez vezes.
Puxe o AAV de três tubos, juntos. Para começar, congele as células re-suspensas colocando-as em um balde contendo gelo seco misturado com etanol. Em seguida, descongele as células colocando-as imediatamente em um banho de água a 37 graus Celsius.
Repita este ciclo de congelamento e degelo três vezes para lise as células e solte as partículas AAV. Após o terceiro passo de descongelamento, centrífuga a 1167 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira cuidadosamente os supernantes para limpar tubos cônicos de 50 mililitros.
Adicione nuclease a cada tubo a uma concentração final de 50 unidades por mililitro de supernaspeuta. Incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos, enquanto gira os tubos a cada 10 minutos para garantir que a nuclease seja completamente misturada com o sobrenante. Centrifugar a 13490 vezes G e a quatro graus Celsius por 20 minutos para esclarecer o supernaspe.
Depois disso, remova o êmbolo de uma seringa de 10 mililitros, conecte um filtro de 0,45 micrômetro à seringa e coloque-a em cima de um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Encha cuidadosamente a seringa com o supernatante esclarecido. Use o êmbolo para forçar o lise através do filtro.
Em seguida, prepare cada uma das frações iodixanol em quatro tubos cônicos separados de 50 mililitros, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Pipeta oito mililitros de 15% de iodixanol em cada um dos três tubos ultracentrífugas. Pipeta 5,5 mililitros de 25% de iodixanol em um tubo cônico limpo de 50 mililitros.
Usando uma pipeta Pasteur não graduada, cuidadosamente camada 5,5 mililitros de solução iodixanol de 25% abaixo da solução iodixanol de 15%. Adicione as soluções de 40% e 60% conforme descrito no protocolo de texto. Frações iodixanol não devem se misturar em camadas.
Usando uma pipeta Pasteur, coloque o liseto bruto em cima do gradiente iodixanol de 15%, gota a gota, para evitar perturbar a interface entre o lise bruto e a solução iodixanol. Encha cada tubo de ultracentrifugação com tampão de lise até que o menisco atinja a base do pescoço do tubo, para garantir que o tubo não entre em colapso sob as forças muito altas geradas durante a ultracentrifugação. Feche os tubos usando tampas apropriadas.
Usando uma escala digital, certifique-se de que todos os três tubos de ultracentrifugação tenham o mesmo peso. Ajustando o peso conforme necessário, adicionando mais tampão de lise em cima do lise bruto. Use um rotor de titânio de ângulo fixo para centrifugar os tubos a 301580 vezes G e a 12 graus Celsius por uma hora e 40 minutos usando aceleração máxima e desaceleração.
Em seguida, anexar uma agulha a uma seringa de cinco mililitros. Remova o espaçador dos tubos do rotor e recupere os tubos após a centrifugação. Aspire apenas a fração de 40% de iodixanol que contém as partículas vetoriais.
Processe a amostra ou armazene-a a quatro graus Celsius. Aqui, é demonstrado um protocolo que pode ser usado para produzir vetores AAV com uma variedade de capsídeos, configurações de genoma, tipos de promotores e cargas transgênicas. Neste exemplo, produzimos e purificamos dois vetores AAV diferentes que expressavam a proteína fluorescente verde a partir de um genoma auto-complementar.
Os dois vetores são distinguidos por capsídeos diferentes:PHPB e AAV9. Eles foram entregues, por injeção de veia traseira, em seis camundongos adultos C57 pretos. Para avaliar os níveis de expressão transgênica três semanas após a injeção, as seções são manchadas com anticorpos primários contra gfp com detecção usando anticorpos secundários conjugados a um corante fluorescente.
As medidas de intensidade de fluorescência mostram um aumento significativo na expressão GFP quando o vetor PHPB é usado em relação ao AAV9. Aumentos no GFP foram observados no cerebrum, no cerebelo e no tronco cerebral. A coleta precisa do vetor contendo fração é crucial para este protocolo.
Caso isso não seja feito corretamente, o rendimento do vetor, bem como a pureza vetorial são adversamente afetados. Sendo capazes de produzir vetores AAV, pequenos laboratórios estarão em posição de aproveitar inúmeras possibilidades experimentais para fornecer genes no sistema nervoso central. Este protocolo requer o uso de uma ultracentrifuagem e é importante receber treinamento adequado antes de lidar com isso para evitar acidentes.
Além disso, os vetores AAV são frequentemente classificados como riscos biológicos e, portanto, você deve consultar as regulamentações locais antes de manuseá-los e gerenciá-los.
