En suivant ce protocole, l’utilisateur sera en mesure de produire des vecteurs AAV de haute pureté et de rendement adaptés aux applications in vitro ou in vivo. Ce protocole peut être utilisé pour produire et purifier une gamme de sérotypes AAV avec des différences dans les configurations. La combinaison de ces deux éléments peut être utile pour obtenir le type de cellule et l’expression spécifique de tissu.
La production de certains sérotypes peut donner à un rendement inférieur. Il s’agit d’une production où il existe des sérotypes proches et doit être évaluée sur une base individuelle. Shelly Fripont, technicienne de notre laboratoire, démontrera ces procédures.
Après la croissance des cellules HEK, mélanger 360 microgrammes de plasmide d’aide, 180 microgrammes de plasmide codant le capsid vectoriel, et 180 microgrammes de plasmide contenant le transgène en 18 millilitres de chlorure de sodium de 150 millimlaires pour préparer le mélange d’ADN. Répartir ce mélange sur trois tubes coniques de 50 millilitres. Dans un nouveau tube conique, mélanger 840 microgrammes de l’Île-du-Prince-Édouard et six millilitres de chlorure de sodium de 150 millimlaires pour préparer le mélange de l’Île-du-Prince-Édouard pour six plats de culture cellulaire.
Ajouter ensuite six millilitres du mélange de l’Île-du-Prince-Édouard, goutte à goutte, à l’un des tubes coniques contenant le mélange d’ADN. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, retirez six plats de culture cellulaire de l’incubateur.
Dans une hotte d’écoulement laminaire, aspirer complètement le milieu de chaque plat. Rincer la vaisselle avec cinq millilitres de DPBS préchauffé pour enlever les traces du milieu. Inclinez doucement chaque plat pour vous assurer que le DPBS est réparti uniformément sur toute la surface.
Ensuite, aspirez doucement le DPBS. Ajouter 12 millilitres de DMEM un à chaque plat lentement, avec une pipette placée sur le bord du plat. Mélangez le mélange de l’Î.-P.-É. et de l’ADN en le faisant monter et descendre trois à cinq fois.
Ajouter deux millilitres de ce mélange à chacun des six plats de culture cellulaire d’une manière goutte à goutte, en s’assurant de le distribuer soigneusement sur toute la surface. Répétez ce processus à l’aide de six plats de culture cellulaire à la fois jusqu’à atteindre 18 plats de culture cellulaire. Secouez doucement les plats de culture cellulaire pour distribuer le mélange d’ADN de l’Î.-P.-É.
Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius avec 95 pour cent d’humidité et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Après cela, ajouter 12 millilitres supplémentaires de DMEM 10 à chacun des 18 plats sans enlever le milieu préexistant. Continuez à couver les cellules transfectées dans les mêmes conditions.
À 72 heures après la transfection, utilisez un grattoir cellulaire pour détacher soigneusement les cellules de chaque plat de culture. Recueillir le milieu et les cellules de deux plats de culture dans un tube conique de 15 millilitres, maintenu sur la glace. Centrifuger les tubes à 420 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avec l’accélération et la décélération de la centrifugeuse réglée au maximum.
Jetez soigneusement le supernatant de chaque tube en le versant doucement dans un récipient d’élimination des déchets. Ensuite, placez les tubes contenant les granulés cellulaires sur la glace. Nous suspendons chaque granulé en deux millilitres de tampon de lyse et mélangeons en pipetting de haut en bas cinq à dix fois.
Tirez l’AAV de trois tubes, ensemble. Pour commencer, congeler les cellules re-suspendues en les plaçant dans un seau contenant de la glace sèche mélangée à de l’éthanol. Décongelez ensuite les cellules en les plaçant immédiatement dans un bain d’eau fixé à 37 degrés Celsius.
Répétez ce cycle de gel et de dégel trois fois pour lyser les cellules et libérer les particules AAV. Après la troisième étape de décongélation, centrifugeuse à 1167 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer délicatement les supernatants pour nettoyer les tubes coniques de 50 millilitres.
Ajouter la nucléase à chaque tube à une concentration finale de 50 unités par millilitre de supernatant. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, tout en tourbillonnant les tubes toutes les 10 minutes pour s’assurer que la nucléase est bien mélangée avec le surnatant. Centrifugeuse à 13490 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour clarifier le surnatant.
Après cela, retirez le piston d’une seringue de 10 millilitres, fixez un filtre de 0,45 micromètre à la seringue et placez-le sur un tube conique propre de 50 millilitres. Remplissez soigneusement la seringue avec le supernatant clarifié. Utilisez le piston pour forcer le lysate à travers le filtre.
Ensuite, préparez chacune des fractions iodixanol en quatre tubes coniques distincts de 50 millilitres, comme indiqué dans le tableau un du protocole de texte. Pipette huit millilitres de 15 pour cent iodixanol dans chacun des trois tubes d’ultracentrifugeuse. Pipette 5,5 millilitres de 25 pour cent iodixanol dans un tube conique propre de 50 millilitres.
À l’aide d’une pipette Pasteur non graduée, superposez soigneusement 5,5 millilitres de solution iodixanol à 25 % en dessous de la solution iodoxanol à 15 %. Ajoutez les solutions de 40 % et 60 % décrites dans le protocole texte. Les fractions iodixanol ne doivent pas se mélanger sur la superposition.
À l’aide d’une pipette Pasteur, superposer le lysate brut au-dessus du gradient iodixanol de 15 %, goutte à goutte, pour éviter de perturber l’interface entre le lysate brut et la solution iodanol. Remplissez chaque tube d’ultracentrifugation d’un tampon de lyse jusqu’à ce que le ménisque atteigne la base du col du tube, pour s’assurer que le tube ne s’effondre pas sous les forces très élevées générées lors de l’ultracentrifugation. Fermez les tubes à l’aide de couvercles appropriés.
À l’aide d’une balance numérique, assurez-vous que les trois tubes d’ultracentrifugation ont le même poids. Ajuster le poids au besoin, en ajoutant plus de tampon de lyse sur le dessus du lysate brut. Utilisez un rotor de titane à angle fixe pour centrifuger les tubes à 301580 fois G et à 12 degrés Celsius pendant une heure et 40 minutes en utilisant une accélération et une décélération maximales.
Ensuite, fixez une aiguille à une seringue de cinq millilitres. Retirez l’espaceur des tubes du rotor et récupérez les tubes après centrifugalisation. N’aspirez que la fraction iodixanol à 40 % qui contient les particules vectorielles.
Soit traiter l’échantillon ou le stocker à quatre degrés Celsius. Ici, un protocole est démontré qui peut être utilisé pour produire des vecteurs AAV avec une variété de capsides, configurations du génome, types promoteurs, et des cargaisons transgéniques. Dans cet exemple, nous avons produit et purifié deux vecteurs AAV différents qui exprimaient la protéine fluorescente verte à partir d’un génome auto-complémentaire.
Les deux vecteurs se distinguent par des capsides différentes : PHPB et AAV9. Ils ont été livrés, par injection de veine de queue, chez six souris noires C57 adultes. Pour évaluer les niveaux d’expression transgénique trois semaines après l’injection, les sections sont tachées d’anticorps primaires contre le GFP avec détection à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent.
Les mesures de l’intensité de fluorescence montrent une augmentation significative de l’expression du PF G lorsque le vecteur PHPB est utilisé par rapport à l’AAV9. Des augmentations de GFP ont été observées dans le cerveau, le cervelet, et dans le tronc cérébral. La collecte précise du vecteur contenant la fraction est cruciale pour ce protocole.
Dans le cas où cela n’est pas fait correctement, le rendement vectoriel ainsi que la pureté du vecteur sont affectés négativement. Capables de produire des vecteurs AAV, les petits laboratoires seront en mesure de profiter de nombreuses possibilités expérimentales pour délivrer des gènes dans le système nerveux central. Ce protocole nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse et il est important de recevoir une formation adéquate avant de le manipuler afin d’éviter les accidents.
En outre, les vecteurs AAV sont souvent classés comme biohazards et, par conséquent, vous devriez consulter les réglementations locales avant de les manipuler et de les gérer.
