Следуя этому протоколу, пользователь сможет производить векторы AAV высокой чистоты и урожайности, подходящие для приложений in vitro или in vivo. Этот протокол может быть использован для производства и очистки ряда серотипов AAV с различиями в конфигурациях. Сочетание этих двух элементов может быть полезно для получения клеточного типа и ткани специфического выражения.
Производство некоторых серотипов может дать более низкую урожайность. Это производство, где есть близкие серотипы и должны быть оценены на индивидуальной основе. Демонстрацией этих процедур будет Шелли Фрипонт, техник из нашей лаборатории.
После выращивания клеток HEK смешайте 360 микрограммов плазмидной помощи, 180 микрограммов плазмидной, кодирующей капсид вектора, и 180 микрограммов плазмиды, содержащей трансген в 18 миллилитров 150 миллимолярный хлорид натрия для подготовки смеси ДНК. Распределите эту смесь по трем 50 миллилитровым коническим трубам. В новой конической трубке смешайте 840 микрограммов PEI и шесть миллилитров 150 миллимолярный хлорид натрия для приготовления смеси PEI для шести блюд клеточной культуры.
Затем добавьте шесть миллилитров смеси PEI, капля за каплей, в одну из конических трубок, содержащих смесь ДНК. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем удалите из инкубатора шесть блюд клеточной культуры.
В ламинарный капюшон потока, полностью аспирировать среды от каждого блюда. Промыть посуду пятью миллилитров предварительно разогретого DPBS, чтобы удалить следы среды. Аккуратно наклоните каждое блюдо, чтобы обеспечить равномерное распределение DPBS по всей поверхности.
Затем аккуратно аспирировать DPBS. Добавить 12 миллилитров DMEM по одному к каждому блюду медленно, с пипеткой размещены на краю блюда. Смешайте PEI и смесь ДНК, трубя его вверх и вниз три-пять раз.
Добавьте два миллилитров этой смеси к каждому из шести блюд клеточной культуры в капле моды, убедившись, что тщательно распределить его по всей поверхности. Повторите этот процесс, используя шесть блюд клеточной культуры одновременно до достижения 18 блюд клеточной культуры. Аккуратно встряхните блюда клеточной культуры, чтобы распределить смесь ДНК PEI.
Инкубировать трансфицированных клеток при 37 градусов по Цельсию с 95 процентов влажности и пять процентов углекислого газа в течение пяти часов. После этого добавьте еще 12 миллилитров DMEM 10 к каждому из 18 блюд, не удаляя уже существующие среды. Продолжить инкубацию трансфицированных клеток в тех же условиях.
В 72 часа после трансфекции используйте клеточный скребок, чтобы тщательно отделить клетки от каждого культурного блюда. Соберите медиум и клетки двух культурных блюд в 15 миллилитровую коническую трубку, хранится на льду. Центрифуга труб в 420 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут с ускорением и замедлением центрифуги установлен на максимум.
Аккуратно выбросьте супернатант из каждой трубки, аккуратно выливая его в контейнер для удаления отходов. Затем поместите трубки, содержащие клеточные гранулы, на лед. Мы приостанавливаем каждую гранулу в два миллилитров буфера лиза и смешиваем, трубя вверх и вниз пять-десять раз.
Вытяните AAV из трех труб, вместе. Для начала заморозить повторно приостановленные клетки, поместив их в ведро, содержащее сухой лед, смешанный с этанолом. Затем оттаивать клетки, немедленно поместив их в водяной бане установлен на 37 градусов по Цельсию.
Повторите этот цикл замораживания и оттепели три раза, чтобы подморозить клетки и выпустить частицы AAV. После третьего шага оттаивания центрифуга в 1167 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Тщательно перенесите супернатанты для очистки 50 миллилитров конических трубок.
Добавьте нуклеазу к каждой трубке до конечной концентрации 50 единиц на миллилитр супернатанта. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, в то время как закрученного труб каждые 10 минут, чтобы убедиться, что нуклеаза тщательно смешивается с супернатантом. Центрифуга при 13490 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут, чтобы прояснить супернатант.
После этого удалите поршень из 10 миллилитров шприца, прикрепите к шприцу фильтр 0,45 микрометра и поместите его поверх чистой 50-миллилитровой конической трубки. Аккуратно заполните шприц уточненным супернатантом. Используйте поршень, чтобы заставить лисировать через фильтр.
Затем подготовь каждую из фракций йодиксанаола в четырех отдельных 50 миллилитровых конических трубках, как указано в таблице одного из текстовых протоколов. Пипетт восемь миллилитров 15 процентов йодиксанола в каждой из трех ультрацентрифуг труб. Pipette 5.5 миллилитров 25 процентов йодиксанола в чистую 50 миллилитров конической трубки.
Используя неизданную трубу Pasteur, тщательно слой 5,5 миллилитров 25 процентов йодиксанола раствор ниже 15 процентов йодиксанола решения. Добавьте 40-процентные и 60-процентные решения, описанные в текстовом протоколе. Фракции йодиксанаола не должны перемешиваться при наслоениях.
Используя пастер пипетку, слой сырой лисат на вершине 15 процентов йодиксанол градиент, капля за каплей, чтобы избежать нарушений интерфейс между сырой лисат и раствор йодиксанол. Заполните каждую ультрацентрифугированную трубку буфером лиза до тех пор, пока мениск не достигнет основания шеи трубки, чтобы трубка не рухнула под очень высокими силами, генерируемыми во время ультрацентрифугации. Закройте трубки с помощью соответствующих крышей.
Используя цифровую шкалу, убедитесь, что все три ультрацентрифугации трубки имеют одинаковый вес. Корректировка веса по мере необходимости, путем добавления большего буфера лиза поверх сырого лизата. Используйте фиксированный угол титанового ротора для центрифуги труб в 301580 раз G и при 12 градусах Цельсия в течение одного часа и 40 минут, используя максимальное ускорение и замедление.
Затем прикрепите иглу к пятими миллилитровому шприцу. Удалите промежитель из труб в роторе, и восстановить трубы после центробежки. Аспирировать только 40 процентов йодиксанол фракции, которая содержит векторные частицы.
Либо обработать образец или хранить его при четырех градусах по Цельсию. Здесь демонстрируется протокол, который может быть использован для производства векторов AAV с различными капсидами, конфигурациями генома, типами промоутеров и трансгенными грузами. В этом примере мы произвели и очищали два различных вектора AAV, которые выражали зеленый флуоресцентный белок из генома.
Два вектора отличаются различными капсидами: PHPB и AAV9. Они были доставлены, через инъекцию хвостовой вены, во взрослых C57 черные шесть мышей. Для оценки уровня трансгенного экспрессии через три недели после инъекции, разделы окрашены первичными антителами против GFP с обнаружением с использованием вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем.
Измерения интенсивности флуоресценции показывают значительное увеличение экспрессии GFP при использовании вектора PHPB по отношению к AAV9. Увеличение GFP наблюдалось в мозге, мозжечка, и в стволе мозга. Точный сбор вектора, содержащего фракцию, имеет решающее значение для этого протокола.
В случае, если это не делается должным образом, отрицательно сказывается урожайность вектора, а также чистота вектора. Будучи в состоянии производить векторы AAV, небольшие лаборатории будут в состоянии воспользоваться многочисленными экспериментальными возможностями для доставки генов в центральной нервной системе. Этот протокол требует использования ультрацентрифуга, и важно, чтобы получить надлежащую подготовку перед обработкой этого, чтобы избежать несчастных случаев.
Кроме того, векторы AAV часто классифицируются как биоопасные и, следовательно, вы должны проконсультироваться с местными правилами, прежде чем обрабатывать и управлять ими.
