هذه التقنية تسمح لنا بقياس قابلية المضادات الحيوية في ظل ظروف أكثر ملاءمة سريريا. كما تسمح لنا هذه التقنية بتحديد التركيز الحقيقي للمضادات الحيوية الذي يمكن أن يقتل البكتيريا في المجاميع. ويمكن تطبيق هذه التقنية على تحديد التركيز اللازم للقضاء على مجاميع GC.
ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة لقياس قابلية مضادات الميكروبات من أي بكتيريا قادرة على تشكيل المجاميع. إيلاء اهتمام دقيق للخطوات تحلل لضمان اكتمال تحلل. وإلا فإن ATP قياس المقايسة يقلل من عدد البكتيريا قابلة للحياة.
وسيسمح التصور لهذه الطريقة للباحثين الآخرين بمتابعة وتكرار هذه التجربة باتساق. تبدأ من قبل streaking Neisseria السيلان، أو سلالات GC، على GCK أجار تكملها 1٪ كيلوغ لاحتضان 16 إلى 18 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي ، استخدم مجهرًا خفيفًا لتحديد المستعمرات السلبية بعناية دون حواف داكنة أو مستعمرات إيجابية بيلي مع حواف داكنة من كل لوحة ، و streak المستعمرات المختارة على لوحات GCK جديدة لثقافة 16 إلى 18 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في صباح اليوم التالي، استخدم قضيب معقمة لجمع مستعمرات GC من كل لوحة و resuspend كل مسحة في مرق دافئ تكملها 4.2٪ بيكربونات الصوديوم و 1٪ محلول كيلوغ. قياس الكثافة البصرية في 650 نانومتر، أو OD650، لتحديد تركيز البكتيريا المعلقة وضبط تركيز GC إلى حوالي مرة واحدة 10 إلى ثمانية وحدات القولون تشكيل لكل ملليلتر. بعد ذلك، أضف 99 ميكرولترات من تعليق GC إلى آبار فردية من لوحة 96 بئرًا والسماح للبكتيريا بتجميعها عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.
في نهاية الحضانة، إضافة ميكرولتر واحد من ceftriaxone المخفف تسلسليا إلى كل بئر ترك بعض الآبار دون علاج لتكون بمثابة ضوابط والعودة لوحة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم التالي، sonicate التعليق في كل بئر ثلاث مرات في 144 واط و 20 كيلوهيرتز لمدة خمس ثوان في صوتنة وإضافة 100 microliters المتاحة تجاريا ATP استخدام كاشف توهج لكل بئر. نقل بعناية 150 ميكرولترات من الخليط من كل بئر إلى آبار فردية من لوحة صغيرة سوداء جديدة 96-well وقياس امتصاص كل بئر في 560 نانومتر على قارئ لوحة.
ثم، حساب معدل البقاء على قيد الحياة من نسبة القراءة التي تم الحصول عليها بعد العلاج بالمضادات الحيوية المسلسل إلى القراءة من الآبار غير المعالجة. للتصور من المجاميع GC الحية / الميتة، واستخدام قضيب عقيم لجمع GC من لوحات مثقف بين عشية وضحاها و resuspend GC في متوسط GCP مسبق الدفء تستكمل مع 1٪ كيلوغ. قياس OD650 بواسطة القياس الطيفي وضبط التركيز إلى ما يقرب من واحد مرات 10 إلى وحدات تشكيل مستعمرة سبعة لكل ملليلتر.
بعد ذلك، أضف 198 ميكروليتر من تعليق GC إلى غرف ثمانية آبار من أسفل الغطاء وتحتضن الغرف عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. في نهاية الحضانة، علاج البكتيريا مع اثنين من ميكرولترات من سيفترياكسون لكل حالة تجميع وإعادة الغرف إلى الحاضنة لفترة الحضانة التجريبية المناسبة. في نهاية الحضانة، إضافة 0.6 ميكرولترات من العيش / الميت تلطيخ حل في كل بئر والعودة الغرف إلى الحاضنة لمدة 20 دقيقة إضافية.
ثم، استخدام المجهر confocal للحصول على الصور سلسلة ع. لقياس حجم مجاميع GC، افتح الصورة الأولى في ImageJ وحدد خطوطًا حرة لتدور حول مساحة كل تجميع في الصورة. انقر فوق تحليل وقياس.
وسيُشار إلى حجم المجاميع تحت عمود المنطقة. لتحديد كمي من نسبة كثافة الفلوريسنس من البقع الحية إلى الميتة في كل تجميع، انقر فوق تحليل وتعيين القياسات والتحقق من الكثافة المتكاملة في النافذة المنبثقة. انقر فوق موافق وانقر على الصورة واللون وأداة القنوات.
حدد اللون والقناة الأولى باعتبارها الفلوريسنس لبكتيريا ميتة تلطيخ. حدد خطوطًا حرة للدائرة في مساحة كل تجميع وانقر فوق التحليل والمقياس للحصول على نسبة كثافة الفلوريسين لكل تجميع في عمود الكثافة المتكامل. حدد القناة الثانية للفلوريسنس للبقعة البكتيرية الحية وقياس كثافة الفلوريسين في كل تجميع كما هو موضح للتو.
ثم تقسيم بيانات كثافة الفلوريسنس الحية من قبل بيانات كثافة الفلوريسنس الميتة للحصول على نسبة كثافة الفلورسين الحية إلى الميتة. في هذه التجربة التمثيلية، تم التعامل مع البكتيريا الإيجابية غير المُزكَّمة، أو البيلي المجمعة أو المجمعة والملتبة بالبكتيريا الإيجابية البيلية مع التخفيفات التسلسلية من سيفترياكسون قبل قياس مستويات ATP الخاصة بها. أظهر GC المُجَرَّز مسبقاً بقاء أعلى بكثير من غير المجمع أو التجميع الذي تعطل GC عند معالجته بتركيزات متساوية من سيفترياكسون أو أعلى.
أظهرت السلالات الإيجابية بيلي التي تشكل مجاميع أكبر أعلى مستويات ATP بعد العلاج ceftriaxone مقارنة سلالات متحولة. بغض النظر عن سلالة اختبارها، حية / ميتة تلطيخ قبل العلاج بالمضادات الحيوية كشفت البكتيريا الميتة تقع إلى حد كبير في الطبقات الخارجية من الثقافة، في حين تم تحديد GC الحية أساسا ضمن جوهر المجاميع المعالجة ceftriaxone. كما هو متوقع، شكلت البكتيريا الإيجابية بيلي أكبر المجاميع، في حين شكلت الثقافات السلبية بيلي أصغر.
وتجدر الإشارة إلى أن المجاميع الإيجابية بيلي كانت لا تزال على قيد الحياة في طبقاتها الأساسية بعد العلاج بالمضادات الحيوية، في حين أن GC في المجاميع الصغيرة فضفاضة متحولة كانت ميتة. استناداً إلى حجم وبقاء GC، يمكن رسم رسم بياني ارتباط لدراسة العلاقة بين حجم التجميع وبقاء المضادات الحيوية للبكتيريا. سونيكيشن مهم للتأكد من أن يتم تحرير ATP من كل بكتيريا فردية داخل المجاميع ملزمة بإحكام.
وإلا فإن القياسات لن تكون متسقة. من المهم أن لوحة البكتيريا بعد تجميعها ويتم علاجها بالمضادات الحيوية لقياس كل من البكتيريا القابلة للحياة وقادرة على النسخ المتماثل. هذه التقنية يقيس تأثير تجميع البكتيريا على قابلية المضادات الحيوية مما يسمح للباحثين لتطوير أدوية أفضل لعلاج الأمراض.
