Bu teknik, klinik olarak daha uygun koşullar altında antibiyotik duyarlılığını ölçmemizi sağlar. Bu teknik aynı zamanda agregalarda bakterileri öldürebilen gerçek antibiyotik konsantrasyonu belirlememize de olanak sağlar. Bu teknik, GC agregalarını ortadan kaldırmak için gerekli konsantrasyonu belirlemek için uygulanabilir.
Bu yöntem aynı zamanda agrega oluşturabilen bakterilerin antimikrobiyal duyarlılığının ölçülmesi için de uygulanabilir. Lysis'in tamamlandığından emin olmak için lysis adımlarına dikkat edin. Aksi takdirde ATP ölçüm tiskomi canlı bakteri sayısını hafife alacaktır.
Bu yöntemin görselleştirilmesi, diğer araştırmacıların bu deneyi tutarlılıkla takip edip çoğaltmalarına olanak sağlayacaktır. Neisseria gonorrhoeae çizgili ile başlayın, veya GC suşları, GCK agar üzerinde 16-18 saatlik kuluçka için% 1 Kellogg ile takviye 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit. Ertesi sabah, her plakadan koyu kenarlara sahip koyu kenarlar veya pili pozitif koloniler olmadan pili-negatif kolonileri dikkatle seçmek için hafif bir mikroskop kullanın ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 16 ila 18 saatlik bir kültür için seçilen kolonileri yeni GCK plakalarına yerleştirin.
Ertesi sabah, her plaka GC kolonileri toplamak ve sıcak suyu her bez askıya steril bir aplikatör kullanın 4.2% sodyum bikarbonat ve% 1 Kellogg çözeltisi ile takviye. Askıya alınan bakterilerin konsantrasyonunu belirlemek için optik yoğunluğu 650 nanometre veya OD650 olarak ölçün ve GC konsantrasyonunu mililitrede sekiz koloni oluşturan ünitelere kadar yaklaşık bir kez 10'a ayarlayın. Daha sonra, 96 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına 99 mikrolitre GC süspansiyonu ekleyin ve bakterilerin 6 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit toplama izin verin.
Kuluçka sonunda, her iyi bazı kuyular kontrol olarak hizmet etmek ve başka bir 24 saat için kuvöz plaka dönmek için tedavi edilmezse bırakarak seri seyreltilmiş seftriakson bir mikrolitre ekleyin. Ertesi gün, sonication başına beş saniye için 144 watt ve 20 kilohertz her kuyuda üç kez süspansiyon sonicate ve her kuyuya ticari olarak kullanılabilir ATP kullanım kızdırma reaktif 100 mikrolitre ekleyin. Her kuyudan 150 mikrolitre karışımı yeni bir 96 kuyulu siyah mikroplakanın ayrı kuyularına dikkatlice aktarın ve her kuyunun emiciliğini bir plaka okuyucuda 560 nanometrede ölçün.
Daha sonra, seri antibiyotik tedavisi sonrası elde edilen okuma oranı ile tedavi edilmeyen kuyulardan okuma oranı hesaplamak. Canlı/ölü GC agregalarının görselleştirilmesi için, bir gecede kültürlenmiş plakalardan GC toplamak ve %1 Kellogg ile desteklenen önceden ısınmış GCP ortamında GC'yi yeniden askıya almak için steril bir aplikatör kullanın. OD650'yi spektrofotometri ile ölçün ve konsantrasyonu mililitrebaşına yedi koloni oluşturan üniteye yaklaşık bir kez 10'a ayarlayın.
Daha sonra, sekiz kuyulu kapaklı alt odaları içine GC süspansiyon 198 mikrolitre ekleyin ve altı saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak odaları kuluçka. Kuluçka sonunda, agregasyon durumu başına iki mikrolitre seftriakson ile bakterileri tedavi edin ve uygun deneysel kuluçka dönemi için odaları kuvöze geri döndürün. Kuluçka sonunda, her kuyuya 0,6 mikrolitre canlı/ölü boyama çözeltisi ekleyin ve odaları 20 dakika daha kuvöze geri verin.
Daha sonra, z-serisi görüntüler elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanın. GC agregalarının boyutunun ölçümü için ImageJ'deki ilk görüntüyü açın ve görüntüdeki her toplama alanının çevresini daire içine almak için serbest el çizgileri seçin. Analiz et ve ölç'e tıklayın.
Agregaların boyutu alan sütununun altında gösterilir. Canlının her bir agregadaki ölü boyama yada floresan yoğunluk oranının ölçülmesi için, analiz etmek ve ölçümleri ayarlamak ve açılır penceredeki entegre yoğunluğu kontrol etmek için tıklayın. Tamam'ı tıklatın ve resim, renk ve kanallar aracını tıklatın.
Ölü bakteri boyama için floresan olarak renk ve kanal bir seçin. Her toplama alanının çevresini daire içine almak için serbest çizgileri seçin ve tümleşik yoğunluk sütunundaki her bir agrega için floresan yoğunluk oranını elde etmek için analiz et ve ölç' e tıklayın. Canlı bakteri boyama için floresan için kanal 2'yi seçin ve her bir agregadaki floresan yoğunluğunu az önce gösterildiği gibi ölçün.
Daha sonra canlı floresan yoğunluğu verilerini ölü floresan yoğunluğu verilerine bölerek canlıdan ölüfloresan yoğunluk oranına geçin. Bu temsili deneyde, agregasız pili pozitif, birleştirilmiş pili pozitif veya birleştirilmiş ve bozulmuş pili pozitif bakteriler ATP düzeylerinin ölçülmeden önce seri seftriakson seyreltmeleri ile tedavi edildi. Preaggregated GC, eşit sayıda seftriakson veya daha yüksek konsantrasyonlarda tedavi edildiğinde, toplu olmayan veya agregasyon bozulmuş GC'den anlamlı olarak daha yüksek bir sağkalım göstermiştir.
Daha büyük agregalar oluşturan pili-pozitif suşlar mutant suşlarına göre seftriakson tedavisinden sonra en yüksek ATP düzeylerini sergiledi. Ne olursa olsun suş test, antibiyotik tedavisi öncesi canlı / ölü boyama büyük ölçüde kültürün dış katmanlarında bulunan ölü bakteriler ortaya, canlı GC seftriakson tedavi agregaların çekirdek içinde ağırlıklı olarak tespit edildi. Beklendiği gibi, pili-pozitif bakteriler en büyük agregaları, pili-negatif kültürler ise en küçük agregaları oluşturmuştur.
Özellikle, pili-pozitif agregalar antibiyotik tedavisinden sonra çekirdek katmanlarında hala hayattaydı, küçük, gevşek mutant agregalarda GC ise ölmüştü. GC'nin büyüklüğü ne ve hayatta kalım larına bağlı olarak, bakterilerin toplama boyutu ile antibiyotik sağkalımı arasındaki ilişkiyi incelemek için bir korelasyon grafiği çizilebilir. Sonication her bir bakteri ATP sıkıca bağlı agregalar içinde serbest olduğundan emin olmak için önemlidir.
Aksi takdirde, ölçümler tutarlı olmayacaktır. Onlar agrega sonra bakteri plaka önemlidir ve hem canlı ve çoğaltma yeteneğine sahip bakterileri ölçmek için antibiyotik ile tedavi edilir. Bu teknik, bakterilerin antibiyotik duyarlılığı üzerindeki etkisini ölçerek araştırmacıların hastalıkların tedavisi için daha iyi ilaçlar geliştirmelerine olanak sağlar.
