Этот метод позволяет измерять восприимчивость к антибиотикам в более клинически значимых условиях. Техника также позволяет нам определить истинную концентрацию антибиотиков, которые могут убивать бактерии в совокупности. Этот метод может быть применен для определения концентрации, необходимой для устранения агрегатов GC.
Метод также может быть применен для измерения противомикробной восприимчивости любых бактерий, способных образовывать агрегаты. Обратите пристальное внимание на этапы лиза, чтобы обеспечить полноту лиза. В противном случае АТФ измерения анализа будет недооценивать количество жизнеспособных бактерий.
Визуализация этого метода позволит другим исследователям следовать и повторить этот эксперимент с последовательностью. Начните с полос Neisseria гонореи, или GC штаммов, на GCK агар дополняется 1%Kellogg для 16 до 18-часовой инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующее утро, используйте световой микроскоп, чтобы тщательно выбрать пили-отрицательных колоний без темных краев или пили-положительных колоний с темными краями от каждой пластины, и полоса взял колоний на новые пластины GCK для 16 до 18-часовой культуры при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
На следующее утро используйте стерильный аппликатор для сбора колоний GC с каждой пластины и повторно поместью каждого тампона в теплом бульоне, дополненном 4,2% бикарбоната натрия и 1% раствора Kellogg. Измерьте оптическую плотность на 650 нанометров, или OD650, чтобы определить концентрацию подвесных бактерий и настроить концентрацию GC примерно в один раз от 10 до восьми единиц колонии, образующих единицы на миллилитр. Далее добавьте 99 микролитров подвески GC в отдельные скважины пластины 96 скважин и позвольте бактериям агрегировать при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение шести часов.
В конце инкубации добавьте один микролитер серийно разбавленного цефтриаксона в каждую скважину, оставляя некоторые скважины необработанными, чтобы служить в качестве элементов управления, и верните пластину в инкубатор еще на 24 часа. На следующий день, sonicate подвески в каждом хорошо три раза на 144 Вт и 20 килогерц в течение пяти секунд на sonication и добавить 100 микролитров коммерчески доступных АТФ использования свечения реагент для каждой хорошо. Тщательно перенесите 150 микролитров смеси из каждой скважины в отдельные скважины нового 96-ну черного микроплоцита и измерьте абсорбаность каждой скважины на 560 нанометров на считыватель пластин.
Затем вычислите выживаемость по соотношению показаний, полученных после серийного лечения антибиотиками, к показанию из необработанных скважин. Для визуализации живых / мертвых агрегатов GC, используйте стерильный аппликатор для сбора GC из ночных культурных пластин и повторного использования GC в довоенной среде GCP дополнен 1%Kellogg. Измерьте OD650 по спектрофотометрии и отрегулируйте концентрацию примерно в один раз 10 до семи колонийообразующих единиц на миллилитр.
Затем добавьте 198 микролитров подвески GC в восьми-хорошо крышки нижних камер и инкубировать камеры при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение шести часов. В конце инкубации обработать бактерии двумя микролитров цефтриаксона на состояние агрегации и вернуть камеры в инкубатор для соответствующего экспериментального инкубационный период. В конце инкубации добавьте в каждую колодец 0,6 микролитров раствора живого/мертвого окрашивания и верните камеры в инкубатор еще на 20 минут.
Затем используйте конфокальный микроскоп для получения изображений серии z. Для измерения размера агрегатов GC откройте первое изображение в ImageJ и выберите линии от руки, чтобы объедить область каждой агрегации изображения. Нажмите проанализировать и измерить.
Размер агрегатов будет указан под столбцей области. Для количественной оценки соотношения интенсивности флуоресценции живого и мертвого окрашивания в каждом агрегате щелкните проанализируйте и установите измерения и проверьте интегрированную плотность всплывающих окон. Нажмите OK и нажмите изображение, цвет и каналы инструмент.
Выберите цвет и канал один, как флуоресценция для окрашивания мертвых бактерий. Выберите линии от руки, чтобы объедить область каждой агрегации и щелкните анализ и измерение, чтобы получить соотношение интенсивности флуоресценции для каждого агрегата в интегрированной колонке плотности. Выберите второй канал для флуоресценции для живого бактериального окрашивания и измерить интенсивность флуоресценции в каждом агрегате, как только что продемонстрировано.
Затем разделите живые данные о интенсивности флуоресценции на данные о мертвой флуоресценции, чтобы получить живое и мертвое соотношение интенсивности флуоресценции. В этом репрезентативном эксперименте, nonaggregated pili положительный, агрегированный pili положительный или агрегированный и нарушенный pili положительные бактерии были обработаны с серийными разбавлениями ceftriaxone перед измерением их уровней АТФ. Преагрегированный GC продемонстрировал значительно более высокую выживаемость, чем неагрегированные или агрегации нарушенных GC при лечении с равными концентрациями цефтриаксона или выше.
Пили-положительные штаммы, которые образуют большие агрегаты выставлены самые высокие уровни АТФ после лечения цефтриаксона по сравнению с мутантными штаммами. Независимо от штамма испытания, живые / мертвые окрашивания до лечения антибиотиками показали мертвых бактерий в значительной степени расположены на внешних слоях культуры, в то время как живые GC были определены в основном в рамках ядра цефтриаксона обработанных агрегатов. Как и ожидалось, пили-положительные бактерии образуют самые большие агрегаты, в то время как пили-отрицательные культуры образуются самые маленькие.
Примечательно, что пили-положительные агрегаты были еще живы в своих основных слоях после лечения антибиотиками, в то время как GC в небольших, свободных мутантных агрегатах были мертвы. Основываясь на размере и выживании ГК, график корреляции может быть построен для изучения взаимосвязи между размером агрегации и выживаемости антибиотиков бактерий. Sonication имеет важное значение для убедившись, что АТФ из каждой отдельной бактерии высвобождается в тесно связанных агрегатов.
В противном случае измерения не будут последовательными. Важно, чтобы пластины бактерий после их агрегирования и лечат антибиотиками для измерения как жизнеспособных и репликации способных бактерий. Методика измеряет влияние агрегации бактерий на восприимчивость к антибиотикам, позволяя исследователям разрабатывать более лучшие препараты для лечения заболеваний.
