טכניקה זו מאפשרת לנו למדוד רגישות לאנטיביוטיקה בתנאים רלוונטיים יותר מבחינה קלינית. הטכניקה גם מאפשרת לנו לקבוע את הריכוז האנטיביוטי האמיתי שיכול להרוג חיידקים באגרגטים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על קביעת הריכוז הדרוש לחיסול אגרגטים GC.
השיטה יכולה להיות מיושמת גם על מדידת הרגישות מיקרוביאלית של כל חיידקים כי הוא מסוגל ליצור אגרגטים. שים לב לצעדי התזה כדי להבטיח שהתוזה הושלמה. אחרת ATP מדידת הראיה תמעיט במספר החיידקים קיימא.
הדמיה של שיטה זו תאפשר לחוקרים אחרים לעקוב ולשכפל את הניסוי הזה בעקביות. התחל על ידי פסים זיבה Neisseria, או זנים GC, על אגר GCK בתוספת 1% קלוג עבור דגירה 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבחור בקפידה מושבות פילי שליליות ללא קצוות כהים או מושבות פילי חיוביות עם קצוות כהים מכל צלחת, ולפס את המושבות הרים על צלחות GCK חדשות לתרבות של 16 עד 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
למחרת בבוקר, השתמש במוליך סטרילי כדי לאסוף מושבות GC מכל צלחת ולתלות מחדש כל ספוגית במרק חם בתוספת 4.2% סודיום ביקרבונט ו 1%פתרון קלוג. למדוד את הצפיפות האופטית ב 650 ננומטר, או OD650, כדי לקבוע את הריכוז של חיידקים מושעים ולהתאים את ריכוז GC על אחד פעמים 10 לשמונה המושבה להרכיב יחידות למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 99 microliters של ההשעיה GC לתוך בארות בודדות של צלחת 96 באר ולאפשר את החיידקים לצבור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות.
בסוף הדגירה, מוסיפים מיקרוליטר אחד של ceftriaxone מדולל סדרתי לכל באר משאיר כמה בארות מטופלות לשמש פקדים ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור במשך 24 שעות נוספות. למחרת, sonicate ההשעיה בכל באר שלוש פעמים ב 144 וואט ו 20 קילוהרץ במשך חמש שניות לכל sonication ולהוסיף 100 microliters של מסחרי זמין ATP ניצול זוהר reagent לכל באר. בזהירות להעביר 150 microliters של תערובת מכל באר לתוך בארות בודדות של microplate שחור חדש 96 היטב ולמדוד את הספיגה של כל באר ב 560 ננומטר על קורא צלחת.
לאחר מכן, לחשב את שיעור ההישרדות על ידי היחס של הקריאה המתקבלת לאחר טיפול אנטיביוטי סדרתי לקריאה מן בארות מטופלים. להדמיה של אגרגטים GC חי / מת, להשתמש במוליך סטרילי כדי לאסוף GC מן הלוחות התרבותיים לילה לשימוש חוזר GC במדיום GCP טרום המלחמה בתוספת 1%Kellogg. למדוד את OD650 על ידי ספקטרופוטומיה ולהתאים את הריכוז כ 10 פעמים לשבע יחידות יוצרות מושבה למיליליטר.
לאחר מכן, הוסיפו 198 מיקרוליטרים של השעיית GC לשמונה תאים תחתונים ומכסים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שש שעות. בסוף האינקובציה, לטפל בחיידקים עם שני microliters של ceftriaxone לכל מצב צבירה ולהחזיר את התאים לאנקובטור לתקופת הדגירה הניסיונית המתאימה. בסוף האינקובציה, מוסיפים 0.6 מיקרוליטרים של תותכת חיה/מתה לכל באר ומחזירים את התאים לאנקובטור למשך 20 דקות נוספות.
לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל כדי להשיג תמונות מסדרת z. למדידת גודל צבירות ה- GC, פתחו את התמונה הראשונה ב- ImageJ ובחרו קווים ביד חופשית כדי להקיף את האזור של כל צבירה בתמונה. לחץ על נתח ולמדוד.
גודל הצבירה יצוין תחת עמודת האזור. לכימות יחס עוצמת הפלואורסצנטיות של כתמים חיים עד מתים בכל צבירה, לחץ על נתח והגדר מדידות ובדוק את הצפיפות המשולבת בחלון המוקפץ. לחצו על הלחצן 'אשר' ולחצו על הכלי תמונה, צבע וערוצים.
בחר צבע לתעל אחד כמו פלואורסצנטיות עבור כתמים חיידקים מתים. בחר קווים חופשיים כדי להקיף את האזור של כל צבירה ולחץ לנתח ולמדוד כדי לקבל את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות עבור כל צבירה בעמודת הצפיפות המשולבת. בחר ערוץ 2 עבור פלואורסצנטיות עבור כתמים חיידקיים חיים ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בכל צבירה כפי שהודגם רק.
לאחר מכן חלקו את נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות החיה על ידי נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות המתה כדי להשיג את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות החיה עד המתה. בניסוי מייצג זה, פילי חיובית ללא הפרעה, פילי צבור חיובי או צבור ושיבש חיידקים חיוביים pili טופלו עם דילול סדרתי של ceftriaxone לפני מדידת רמות ATP שלהם. GC preaggregateed הפגין הישרדות גבוהה משמעותית מאשר לא מצטבר או צבירה שיבשה GC כאשר מטופלים עם ריכוזים שווים של ceftriaxone ומעלה.
זנים חיוביים פילי כי טופס אגרגטים גדולים יותר הציגו את רמות ATP הגבוהות ביותר לאחר טיפול ceftriaxone בהשוואה זנים מוטציה. ללא קשר למתח שנבדק, כתמים חיים / מתים לפני טיפול אנטיביוטי גילה חיידקים מתים הממוקמים בעיקר בשכבות החיצוניות של התרבות, בעוד GC חי זוהו בעיקר בתוך הליבה של אגרגטים שטופלו ceftriaxone. כצפוי, חיידקים פילי חיוביים יצרו את הצבירה הגדולה ביותר, בעוד תרבויות פילי שליליות יצרו את הקטן ביותר.
יש לציין כי אגרגטים חיוביים פילי היו עדיין בחיים בשכבות הליבה שלהם לאחר טיפול אנטיביוטי, ואילו GC באגרגטים מוטנטים קטנים, רופף היו מתים. בהתבסס על גודלו והישרדותו של ה- GC, ניתן לתכנן גרף מתאם כדי לבחון את הקשר בין גודל הצבירה להישרדות האנטיביוטית של החיידקים. Sonication חשוב לוודא כי ATP מכל חיידק בודד הוא שוחרר בתוך אגרגטים כבול היטב.
אחרת, המדידות לא יהיו עקביות. חשוב צלחת החיידקים לאחר שהם מצטברים ומטופלים עם אנטיביוטיקה כדי למדוד הן את החיידקים קיימא ואת החיידקים מסוגלים שכפול. הטכניקה מודדת את השפעת צבירת החיידקים על רגישות לאנטיביוטיקה ומאפשרת לחוקרים לפתח תרופות טובות יותר לטיפול במחלות.
