Diese Technik ermöglicht es uns, die Antibiotikaanfälligkeit unter klinisch relevanteren Bedingungen zu messen. Die Technik ermöglicht es uns auch, die wahre Antibiotikakonzentration zu bestimmen, die Bakterien in Aggregaten abtöten kann. Diese Technik kann angewendet werden, um die Konzentration zu bestimmen, die für die Beseitigung von GC-Aggregaten erforderlich ist.
Die Methode kann auch angewendet werden, um die antimikrobielle Anfälligkeit von Bakterien zu messen, die in der Lage sind, Aggregate zu bilden. Achten Sie sorgfältig auf die Lyseschritte, um sicherzustellen, dass die Lyse abgeschlossen ist. Andernfalls wird der ATP-Messtest die Anzahl lebensfähiger Bakterien unterschätzen.
Die Visualisierung dieser Methode wird es anderen Forschern ermöglichen, dieses Experiment mit Konsistenz zu verfolgen und zu replizieren. Beginnen Sie mit dem Streichen Von Neisseria gonorrhoeae, oder GC-Stämme, auf GCK Agar ergänzt mit 1%Kellogg für eine 16 bis 18-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Morgen verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um pili-negative Kolonien ohne dunkle Kanten oder pili-positive Kolonien mit dunklen Kanten von jeder Platte sorgfältig auszuwählen, und streifen Sie die ausgewählten Kolonien auf neue GCK-Platten für eine 16- bis 18-Stunden-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Verwenden Sie am nächsten Morgen einen sterilen Applikator, um GC-Kolonien von jeder Platte zu sammeln und jeden Tupfer in warmer Brühe wieder aufzusetzen, ergänzt mit 4,2% Natriumbicarbonat und 1%Kellogg-Lösung. Messen Sie die optische Dichte bei 650 Nanometern oder OD650, um die Konzentration der suspendierten Bakterien zu bestimmen und die GC-Konzentration auf etwa ein mal 10 auf die acht koloniebildenden Einheiten pro Milliliter einzustellen. Als nächstes fügen Sie 99 Mikroliter der GC-Suspension in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte und lassen Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden zu aggregieren.
Am Ende der Inkubation einen Mikroliter seriell verdünntes Ceftriaxon zu jedem Brunnen hinzufügen, so dass einige Brunnen unbehandelt bleiben, um als Steuerung zu dienen und die Platte für weitere 24 Stunden an den Inkubator zurückzugeben. Am nächsten Tag beschallen Sie die Suspension in jedem Brunnen dreimal mit 144 Watt und 20 Kilohertz für fünf Sekunden pro Beschallung und fügen Sie 100 Mikroliter handelsüblichen ATP-Nutzungsglühen-Reagenz zu jedem Brunnen hinzu. Übertragen Sie vorsichtig 150 Mikroliter Mischung aus jedem Brunnen in einzelne Brunnen einer neuen 96-Well-Schwarzen Mikroplatte und messen Sie die Absorption jedes Brunnens bei 560 Nanometern auf einem Plattenleser.
Berechnen Sie dann die Überlebensrate nach dem Verhältnis des Nachdereiner der seriellen Antibiotikabehandlung erhaltenen Messwerts zum Ablesen aus den unbehandelten Brunnen. Für die Visualisierung der lebenden/toten GC-Aggregate verwenden Sie einen sterilen Applikator, um GC aus den über Nacht kultivierten Platten zu sammeln und das GC in vorgewärmtem GCP-Medium, ergänzt mit 1%Kellogg, wieder aufzusetzen. Messen Sie den OD650 mittels Spektrophotometrie und passen Sie die Konzentration auf etwa ein mal 10 auf die sieben koloniebildenden Einheiten pro Milliliter an.
Als nächstes fügen Sie 198 Mikroliter GC Suspension in acht Well-Abdeckung-Boden-Kammern und inkubieren die Kammern bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Behandeln Sie die Bakterien am Ende der Inkubation mit zwei Mikroliterceftriaxon pro Aggregationszustand und bringen Sie die Kammern für die entsprechende experimentelle Inkubationszeit an den Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation 0,6 Mikroliter lebende/tote Färbelösung in jeden Brunnen geben und die Kammern für weitere 20 Minuten in den Inkubator zurückgeben.
Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop, um Bilder der Z-Serie zu erhalten. Um die Größe der GC-Aggregate zu messen, öffnen Sie das erste Bild in ImageJ, und wählen Sie Freihandlinien aus, um den Bereich jeder Aggregation im Bild zu umkreisen. Klicken Sie auf Analysieren und Messen.
Die Größe der Aggregate wird unter der Flächenspalte angegeben. Zur Quantifizierung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses von Leben deiner lebenden zur abgestorbenen Färbung in jedem Aggregat klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen und überprüfen Sie die integrierte Dichte im Popup-Fenster. Klicken Sie auf OK und klicken Sie auf Bild, Farbe und Kanäle Werkzeug.
Wählen Sie Farbe und Kanal eins als Fluoreszenz für abgestorbene Bakterien Färbung. Wählen Sie Freihandlinien aus, um den Bereich jeder Aggregation zu umkreisen, und klicken Sie auf Analysieren und Messen, um das Fluoreszenzintensitätsverhältnis für jedes Aggregat in der integrierten Dichtespalte zu erhalten. Wählen Sie Kanal zwei für die Fluoreszenz für die lebende bakterielle Färbung und messen Sie die Fluoreszenzintensität in jedem Aggregat, wie soeben gezeigt.
Dividieren Sie dann die Daten zur Live-Fluoreszenzintensität durch die toten Fluoreszenzintensitätsdaten, um das Verhältnis der Live-zu-Tot-Fluoreszenzintensität zu erhalten. In diesem repräsentativen Experiment wurden nicht aggregierte pili-positive, aggregierte pili-positive oder aggregierte und gestörte pili-positive Bakterien vor der Messung ihrer ATP-Spiegel mit seriellen Verdünnungen von Ceftriaxon behandelt. Voraggregierte GC zeigten ein signifikant höheres Überleben als nicht aggregierte oder aggregationsgestörte GC, wenn sie mit gleichen Konzentrationen von Ceftriaxon oder höher behandelt wurden.
Pili-positive Stämme, die größere Aggregate bilden, wiesen die höchsten ATP-Werte nach ceftriaxon-Behandlung im Vergleich zu den mutierten Stämmen auf. Ungeachtet der getesteten Stämme ergaben lebende/tote Färbungen vor der Antibiotikabehandlung tote Bakterien, die sich größtenteils an den äußeren Schichten der Kultur befanden, während live GC hauptsächlich im Kern von Ceftriaxon-behandelten Aggregaten identifiziert wurden. Wie erwartet bildeten pili-positive Bakterien die größten Aggregate, während pili-negative Kulturen die kleinsten bildeten.
Bemerkenswert ist, dass pili-positive Aggregate nach der Antibiotikabehandlung noch in ihren Kernschichten am Leben waren, während GC in den kleinen, lockeren mutierten Aggregaten tot waren. Basierend auf der Größe und dem Überleben des GC kann ein Korrelationsdiagramm dargestellt werden, um die Beziehung zwischen der Aggregationsgröße und dem Überleben der Bakterien zu untersuchen. Beschallung ist wichtig, um sicherzustellen, dass ATP von jedem einzelnen Bakterium innerhalb der eng gebundenen Aggregate freigesetzt wird.
Andernfalls sind die Messungen nicht konsistent. Es ist wichtig, die Bakterien zu plattieren, nachdem sie sich aggregieren und mit Antibiotika behandelt werden, um sowohl die lebensfähigen als auch die replikationsfähigen Bakterien zu messen. Die Technik misst den Einfluss der Bakterienaggregation auf die Antibiotikaanfälligkeit, so dass Forscher bessere Medikamente zur Behandlung von Krankheiten entwickeln können.
