يمكن للجزيء الواحد FRET التقاط الديناميكيات التي تحدث على مسافات نانومتر ، وهو المقياس الصحيح لعملية التمثيل الحيوي للبروتين الريبوسومي. ريبوسوم يعمل من خلال تنسيق عوامل ومكونات متعددة allosterically، وهو في جوهره غير متجانسة. يمكن أن تتبع طريقة جزيء واحد كل ريبوسوم دون أن تكون محدودة من قبل هذا التأثير المتوسط غير متجانسة.
ستكشف هذه الطريقة كيف تمنع المضادات الحيوية وظيفة الريبوسوم لتطوير أدوية جديدة نحو العدوى البكتيرية المقاومة للأدوية. ابدأ بإعداد PRE عن طريق خلط مزيج EFTU و NOG و PAG عند نسبة واحد إلى اثنين إلى اثنين عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد الحضانة، قم بتنقية PRE باستخدام 1.1 جهاز طرد فائق الطارد فائق الطارد لوسادة الضروس بين عشية وضحاها عند 100، 000 مرة G.Prepare THE POST عن طريق خلط مزيج EFTU وWG و PHE بنسبة من واحد إلى اثنين إلى اثنين عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة، قم بتنقية POST باستخدام 1.1 جهاز طرد فائق للطرد الفائق لوسادة السكروز الضرس بين عشية وضحاها بمعدل 100,000 مرة G.Clean الزجاج المجهري الذي يحتوي على ستة أزواج من الثقوب التي يبلغ قطرها ملليمتر واحد وأغطية الزجاج المجهر رقم 1.5. خبز الشرائح النظيفة وأغطية في 300 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات، ثم معطف coverslip مع الأمينوسالين. في غطاء نظيف صفح، وضع واحد coverlip شقة على السطح.
إسقاط بعناية 60 ميكرولتر من محلول PEG على الحافة العلوية ، ثم وضع غطاء آخر فوقه ، مما يتيح للتأثير الشعري نشر الحل بينهما لضمان عدم تشكيل فقاعات. كرر هذه الخطوات لأزواج أكثر من coverslips. تخزين هذه الأغطية في مربع تلميح فارغة مليئة بالماء واحتضانها لمدة ثلاث ساعات في الظلام.
بعد ثلاث ساعات، فصل الأغطية، وشطف بالماء في ثلاث بوتقات متتالية وتطهير مع تيار النيتروجين الجاف. سحب نصائح حادة ماصة من خلال الثقوب على الشرائح الزجاجية حتى تناسب بإحكام. كشط ينتهي حاد قبالة حتى تكون مسطحة تماما مع السطح الزجاجي، ثم قطع شريط مزدوج الوجه مع نمط القناة على ذلك.
عصا على الشرائح الزجاجية على الجانب المسطح. عصا coverslip المغلفة على الشريط الوجه المزدوج واضغط على ذلك لجعل ختم ضيق من غرفة العينة، والتأكد من الجانب المغلفة تواجه الداخل. قم بتشغيل الكمبيوتر ومفتاح المجهر.
بدء تشغيل واجهة التحكم بالليزر، وبدوره على الليزر. اضغط على زر التمكين الموجود في مربع التحكم بالليزر لتسخين الليزر. قم بتشغيل الكاميرات، ثم ابدأ تشغيل برنامج المجهر المقترن.
انقر فوق مصراع العلوي قبالة وانقر على المصباح. قم بإعداد TAM10 مع المخزن المؤقت Tween بإضافة 10 ميكرولتر من 5٪ Tween-20 إلى ملليلتر واحد من المخزن المؤقت TAM10. إعداد محلول deoxy عن طريق وزن ثلاثة ملليغرام من الجلوكوز oxidase في أنبوب صغير microcentrifuge وإضافة 45 ميكرولتر من كاتالاز إليها.
دوامة الأنبوب بلطف لإذابة الصلبة. تدور في 20، 000 مرة G في جهاز طرد دقيق لمدة دقيقة واحدة واتخاذ supernatant. إعداد محلول الجلوكوز 30٪، 200 ميلمولار ترولوكسي الحل و 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول ستريبتافيدين باتباع التعليمات في المخطوطة النصية.
إضافة قطرة واحدة من زيت التصوير إلى هدف العشب. ضع حجرات العينة على الهدف. ملء الغرفة مع 10 ميكرولتر من الحل streptavidin وانتظر لمدة دقيقة واحدة.
اغسل الغرفة ب 30 ميكرولتر من TAM10 مع مخزن توين المؤقت، وجمع محلول التشغيل من خلال ورقة فلتر مطوية. انتظري دقيقة واحدة بعد الغسيل. تمييع المجمعات الريبوسوم PRE أو POST إلى تركيزات نانومولار 10-15 مع TAM10 مع العازلة توين.
تحميل 20 ميكرولتر من عينة ريبوسوم في القناة وانتظر لمدة دقيقتين. جعل العازلة التصوير باستخدام 50 ميكرولتر من TAM10 العازلة و0.5 ميكرولتر كل من محلول deoxyglucose وترولوكس. اخلطها جيدا.
اغسل الغرفة ب 30 ملليلتر من المخزن المؤقت للتصوير. تعيين الكاميرا للحصول على الصور. انقر فوق الغالق العلوي على المصباح وإيقاف تشغيله.
بدء اقتناء الكاميرا ونشر الصور في ثلاث نوافذ تمثل اثنين من الكاميرات الفردية وتراكب. ضمن القائمة الحصول على، حدد التقاط الفاصل الزمني، ومن ثم انقر على التقاط تلقائيا. تعيين اسم الملف المناسب، ومسار الملف، وعدد الحلقات وانقر على تشغيل الآن.
أغلق النافذة المنبثقة بمجرد اكتمال الحصول على الصورة ثم افتح الملف ND المكتسبة. انقر على عائد الاستثمار، محرر عائد الاستثمار بسيطة واختيار دائرة الخيار. حدد عائد الاستثمار على الصورة وانقر على النهاية عند اكتماله.
انقر على القياس، وقياس الوقت لإظهار البيانات إما كمؤامرة أو جدول بيانات. فتح علامة التبويب تصدير لتعيين المعلمات التصدير، ثم انقر على التصدير لحفظ كثافة. وأخيرا، افتح الملف الذي تم تصديره باستخدام تطبيق مناسب.
المسافة من بقايا وضع العلامات L27 إلى الجيش الملكي النيبالي A-الموقع أو P-الموقع هو 61 أو 52 angstrom على التوالي، المقابلة لكفاءة FRET من 0.47 و 0.65. تم استرجاع وشدة فلوريسنس من قنوات المانح والمقبل ورسمها كتهلير زمني. بعد تبييض المانحة، اقترب كلا الأثرين من خط الأساس لأنه لا يمكن أن يحدث أي إثارة مباشرة على المقبول.
بعد تبييض المقبول ، زادت كثافة المتبرع لأن مسارات التفاعل الأقل تبدد طاقة الإثارة. وأظهرت الريبوسومات الفردية تقلبات مختلفة بسبب الحركة المتذبذبة للرنانات، التي تسببت في تقلبات المسافة إلى L27. طرق أخرى مثل Puromycin المقايسة، المقايسة، اختبار بصمة القدم والمواصفات الشامل هي مجانية لطريقة FRET جزيء واحد وتكشف عن مزيد من التفاصيل حول تخليق البروتين.
يحتوي FRET أحادي الجزيء على تطبيق واسع لأن العديد من العمليات البيولوجية تحدث في نطاق النانومتر وفي الجداول الزمنية بالمللي ثانية. من خلال وضع علامات على الأصباغ المناسبة في المواقف المناسبة ، يمكن الكشف عن العديد من الديناميكيات الأخرى.
