1-الثقافات S. cerevisiae والتعبير البروتين
ملاحظة: متغيرات Aβ يحمل المزيف التجميع نسبية مختلفة بسبب طفرة في رواسب واحدة في موقف الببتيد Aβ42 (الشكل 1A) 19 (Phe19). هذه المتغيرات الببتيد الموسومة بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، الذي يعمل ك مراسل (الشكل 1) تجميع29.
<ol><li>تحويل والبلازميدات الترميز للمتغيرات Aβ42-بروتينات فلورية خضراء 20 في خلايا الخميرة مع BY4741 خلفية أبوية (ماتا له3Δ1 لوي2Δ0 التقى15Δ0 ura3Δ0)30. بلازميد كل ترميز للمسخ Aβ42 تنصهر للتجارة والنقل برابط جسجسج. البلازميدات pESC(-URA) وتشمل علامة التحديد URA329.<ol>
<li>إعداد متوسطة كاملة الاصطناعية دون اليوراسيل (SC-اتفاق جولة أوروغواي) مع المكونات التالية: 1.9 غرام/لتر النيتروجين الخميرة قاعدة دون اليوراسيل و 5 غرام/لتر كبريتات الأمونيوم 900 مل ddH2س جنبا إلى جنب مع 100 مل السكر 20% (w/v).</li>
		<li>وضع مستعمرة واحدة من خلايا الخميرة المحولة إلى 20 مل المتوسط SC-اتفاق جولة أوروغواي الذي يحتوي على 2% جلوكوز وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 210 لفة في الدقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في اليوم التالي، تنمو الثقافات خلايا الخميرة الجديدة بتطعيم 100 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها إلى 5 مل من الطازجة SC-أورا المتوسطة.</li>
	<li>في OD590 0.5، الطرد المركزي الثقافات في ز س 3,000 لمدة 4 دقائق وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في نفس الحجم من المتوسطة SC-أورا الطازجة التي تحتوي على رافينوسي 2%.</li>
	<li>احتضان عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 210 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي الخلايا في 3,000 غ س ل 4 دقيقة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة SC-أورا الطازجة التي تحتوي على اللبن 2% للحث على تعبير البروتين المؤتلف.</li>
	<li>بعد 16 ساعة من حمل التعبير البروتين في مقرر اتفاقية استكهولم--أورا المتوسطة التي تحتوي على اللبن 2%، الحصاد 1 مل الخلايا المستحثة في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة بالطرد المركزي في 3,000 ز س لمدة 4 دقائق. ملاحظة: تحدث الاختلافات الأكثر صلة بالموضوع بعد فترة التعريفي لخلايا الخميرة تسبب حاء 16 التعبير عن المتغيرات Aβ42-التجارة والنقل يمكن تصور بالأسفار الفحص المجهري لتحديد توزيع المؤتلف البروتين داخل الخلايا (الشكل 2).</li>
</ol>2-خلية تلطيخ
ملاحظة: الخلايا المستحثة بغير جديدة مطلوبة كعنصر تحكم سلبية لتحديد عتبة فلورسنت أثناء تحليل FC.
<ol><li>خلايا الخميرة التي يسببها ح 16 وتحديد كثافتها الضوئية في 590 نانومتر (OD590). تمييع لهم في الملحية فوسفات عقيمة مخزنة (PBS) ل التطوير التنظيمي590 من 0.1.<ol>
<li>إعداد 1 × المالحة الفوسفات مخزنة على النحو التالي: أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم بوكل، ز 1.44 غ2هبو4، وملء 0.24 ز خ2ص4 إلى 800 مل ddH2سين الحل ما يصل إلى 1 لتر من ddH2س بعد ضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. تصفية المخزن المؤقت عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل تعليق خلية وإذ تعرب عن أنابيب مناسب المسمى (12 × 75 مم مستديرة القاع البوليستيرين) وحمايتهم من الضوء. تأكد من أنهم على استعداد ليتم تحميلها على سيتوميتير تدفق للتحليل، جنبا إلى جنب مع الخلايا المستحثة بغير وغير الملون.</li>
	<li>إضافة المسبار الأكسدة (مثلاً، سيلروكس الأحمر العميق) لكل عينة في تركيز نهائي من 5 ميكرومتر واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.</li>
	<li>بعد الحضانة، تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 x PBS وريسوسبيند لهم في نفس حجم المخزن المؤقت قبل التحليل بنادي.</li>
</ol>3-التدفق الخلوي التحليل
ملاحظة: استخدام إعداد FC أشعة الليزر المناسبة ومرشحات، والكشف عن بروتينات فلورية خضراء والأكسدة مسبار fluorescence إشارة. يمكن استخدام سيتوميتير تدفق مجهزة 488 نانومتر أزرق ليزر للكشف عن بروتينات فلورية خضراء وليزر نانومتر أحمر 635 للكشف عن الأكسدة مسبار الأسفار. يتم الحصول على انبعاث الأسفار للتجارة والنقل، ومسبار الأكسدة مع عامل تصفية 530/30 نانومتر BP وعامل تصفية شركة بريتيش بتروليوم 660/20، على التوالي (الجدول 1).
<ol><li>انقر فوق فتح لوحة ورقة عمل جديدة وخلق المؤامرات دوت اقتناء التالية.<ol>
<li>حدد أداة مؤامرة مبعثر من شريط الأدوات وإنشاء مؤامرة مع المتغيرات الجانب مبعثر-المنطقة (SSC-أ) على المحور الصادي مقابل مبعثر ناحية الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) في مقياس خطي على المحور س.</li>
		<li>انقر فوق مبعثر مؤامرة أداة من شريط الأدوات وخلق مؤامرة مع المتغيرات FL1-منطقة (فيتك) على المحور ص. FL3-منطقة (APC) في مقياس لوغاريتمي على المحور ص.</li>
	</ol>
</li>
	<li>انقر فوق رمز إعدادات الصكوك . انقر فوق علامة التبويب التعويض وتعيين جميع مستويات التعويض. انقر فوق علامة التبويب اقتناء وحدد عدد إجمالي من 20,000 الأحداث التي سيتم تسجيلها.</li>
	<li>انقر فوق رمز معدل التدفق للتبديل معدل التدفق إلى منخفض.</li>
	<li>انقر فوق علامة التبويب الحصول على بدء تشغيل الخلايا المستحثة بغير، أونستاينيد وضبط الجهد في إعدادات صك من الأمام والجانب المبعثر حتى يتم توزيع السكان في الربع السفلي الأيمن الأوسط.<ol>
<li>انقر على أيقونة مضلع تعيين منطقة R1 حول السكان الخلية باستثناء خلية الحطام، واستخدام هذه الفئة من السكان بوابة P1 = R1 لجميع المؤامرات نقطة مضيئة وتمثيلات الرسم البياني (الشكل 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>لضبط الجهد PMT إشارة الأسفار، تشغيل الخلايا أونستاينيد في المؤامرة دوت FL1-FL3، ضبط المكاسب في التبويب إعداد الصك ، حتى يتم توزيع الخلايا في الربع الأيسر السفلي.</li>
	<li>تغيير العينة في الخلايا المستحثة لقياس fluorescence التجارة والنقل. في التبويب إعداد الصك ، تعيين المكسب في منتدى التعاون الأمني، مقابل FL1 (فيتك) عندما يتم توزيع السكان في الربع الأيسر السفلي. تعريف السكان خلية إيجابي مع بوابة (بوابة P2).</li>
	<li>تغيير العينة لعدم فعل الملون الخلايا لعرض الأكسدة بالأسفار في مؤامرة دوت FL3 (APC) منتدى التعاون الأمني مقابل . ضبط المكاسب حتى يتم توزيع السكان خلية في الربع العلوي الأيسر. بوابة سكان الخلية إيجابية P3.</li>
	<li>جعل قطعتي الرسم البياني مع الرمز المدرج التكراري لتمثيل fluorescence الخلية. لتمثيل شدة الأسفار، تأكد من FL1 (فيتك) تمثل الأسفار بروتينات فلورية خضراء في المحور س، و FL3 (APC) تمثل الأسفار في المحور الصادي، تطبيق السكان P2 و P3 في مقياس لوغاريتمي، على التوالي. ملاحظة: الرسم البياني تراكبات طريقة جيدة لتوضيح الاختلافات بين ملفات تعريف صف خلايا معربا عن متغيرات Aβ المختلفة.</li>
</ol>4-المؤتلف البروتين إيمونوديتيكشن
<ol><li>لتحديد مستويات التعبير البروتين، حصاد ثقافات الخميرة الناجمة عن الطرد المركزي في س 4,000 ز 6 دقيقة عن ح 16، وتخزين الكريات الخلية في-80 درجة مئوية.<ol>
<li>ريسوسبيند الخلايا المجمعة معربا عن البروتين المؤتلف ح 16 في برنامج تلفزيوني. إعداد 200 تعليق خلية ميليلتر من كل متحولة Aβ42-التجارة والنقل ل التطوير التنظيمي590 من 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لتحليل الكسر البروتين الكلي، حصد 100 ميليلتر من كل متحولة بالطرد المركزي في س 14,000 ز لمدة 20 دقيقة وريسوسبيند الكريات خلية في نفس حجم المخزن المؤقت لتحلل الخميرة Y-الواحدة (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 1% [دمس]، 200 ملم كلوريد الصوديوم، يدتا 1 ملم تحتوي على 10 ملغ/مل SB3-14 (myr سولفوبيتيني إيستيل) وتستكمل مع فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 1 مم (بمسف)).<ol>
<li>احتضان العينات عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات معتدل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد تركيز استخراج البروتين باستخدام مقايسة برادفورد. تحميل تصل إلى 5 ميكروغرام لاستخراج البروتين من كل عينة على جل التفريد الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الاكريلاميد 15% ووصمة عار على غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن في 100 الخامس لمدة 60 دقيقة.<ol>
<li>إعداد برادفورد حله في 50 مل إيثانول 95% كاشف مع 100 مغ G-250 "أخذ الأزرق الرائعة" وإضافة 100 مل حامض الفوسفوريك 85% (w/v). ثم، عندما يتم حل الصبغة تماما، تمييع المخلوط مع ddH2س إلى 1 لتر وتصفيته من خلال ورق الترشيح السيليلوز فقط قبل استخدام. ملاحظة: الكاشف برادفورد وينبغي أن يكون الضوء براون.</li>
		<li>إعداد معيار ألبومين المصل البقري (BSA) تتراوح ما بين 5-100 ميكروغرام من البروتين في ميليلتر 1,000 للكاشف برادفورد.</li>
		<li>إضافة 1-10 ميليلتر بروتين استخراج إلى 1 مل الكاشف برادفورد واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>قياس امتصاص المعايير واستخراج عينات في التطوير التنظيمي595من البروتين.</li>
		<li>للتحليل، وجعل مؤامرة مع امتصاص القيم التي تم الحصول عليها للمعايير مقابل. ميكروغرام بروتين. اعتماداً على المنحنى المعياري، تحديد تركيزات عينات الأصلي من كمية البروتين، نظراً لحجم وتمييع، أن وجدت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>شطف الغشاء مع 1 × تريس مخزنة المالحة (تبس)، 0.1% 20 توين (تتبس)، وحظر استخدام اللبن المجفف الخالي 5% (w/v) في 1 x TTBS.<ol>
<li>لتحضير 1 لتر 10 x TBS، حل ز 24 من قاعدة تريس و 88 جرام من كلوريد الصوديوم في 900 مل ح2سدد وضبط درجة الحموضة إلى 7.6. إضافة ddH2س إلى وحدة تخزين نهائي للأم 1 لحل 1 x، مزيج الجزء 1 من 10 x الأسهم مع 9 أجزاء من ddH2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>احتضان الغشاء ح 1 مع 1:1,000 6E10 تضعف جسم بيتا-اميلويد الأولية، وعن ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع عنزة جسم ثانوية تضعف الماوس المضادة مفتش HRP المتقارن 01:10، 000.</li>
	<li>وضع 1 مل كاشف فلوري لوميناتا باستخدام الأغشية وتحديد نطاقات بتحليل دينسيتوميتريك كما هو موضح في الخطوة 5، 2.</li>
</ol>5-بيانات التحليل
<ol><li>لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها من لجنة التيسير، إنشاء جدول عرض متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) والأسفار الوسيط مع الخطأ القياسي الخاص به المطابق و/أو معامل التباين (CV) للأسفار بروتينات فلورية خضراء ومستويات الأكسدة.<ol>
<li>انقر فوق علامة التبويب المفتش والرمز الإحصاءات لتخصيص البيانات الإحصائية المطلوبة لكل قناة. ملاحظة: عند مقارنة المتغيرات البروتين، تحويل بيانات القيم الأسفار إلى خلفية أكثر من إضعاف أو القرار متري (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> في هذا المقياس، متوسط العينة هو الأسفار يعني المشكلة عينات مراقبة يعني fluorescence متوسط الخلايا المستخدمة كعنصر تحكم و SD هو الانحراف المعياري للأسفار يعني. عامل RD مؤشر أكثر دقة من قيمة مؤسسة مونتانيار، فإنه ليس فقط بحساب الفرق بين العينات ولكن أيضا حسابات لنشر البيانات. هذا الحساب على وجه التحديد ذات الصلة عند مقارنة البيانات الواردة من مختلف التجارب التي نفذت على مر الزمن. مرة واحدة قد حسبت طلقة، المستحسن استخدام الاختبار الإحصائي لتأكيد أهمية الاختلافات الملحوظة بين الخيارين البروتين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>للبروتين إيمونوديتيكشن، قياس مستويات البروتين المؤتلف بوصمة عار الغربية باستخدام البرمجيات إيماجيج.<ol>
<li>قبل تحليل قياس كثافة، تحويل الصور الخام الأصلي للغشاء نمواً في وضع اللون الرمادي وتنسيق ملف JPEG.</li>
		<li>ضبط المقطع تعيين قياسات القائمة تحليل تعني قيمة الرمادي.</li>
		<li>انقر فوق الأداة مستطيل من إيماجيج وتعريف منطقة الاهتمام (ROI) بحجم متسقة لتحليل قياس كثافة الفرقة. مركز كل الفرقة على صورة غشاء داخل إطار مستطيل تم إنشاؤه وسجل القياس واحداً تلو الآخر باستخدام Ctrl + M (الأمر القياس).</li>
		<li>قياس الخلفية المحلية المجاورة لكل الفرقة، وتطبيق نفس المنطقة العائد على الاستثمار. بعد القياس، طرح الخلفية المحلية المناظرة من كل الفرقة الفردية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo:+the+role+of+molecular+chaperones.">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy.">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li><li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation.">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+out+of+shape.">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+functional+amyloid,+and+human+disease.">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li><li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+diseases:+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives.">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li><li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart:+a+clinical+overview.">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li><li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson's+disease.">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li><li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li><li>Mishra, R., Sj&#246;lander, D., Hammarstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red.">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay.">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast?.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li><li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+is+good:+yeast+models+of+neurodegeneration.">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li><li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+model+of+amyloid-&#946;+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer's+disease.">Yeast model of amyloid-&#946; and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li><li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex.">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Braun, R. J., B&#252;ttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+yeast:+modeling+neurotoxic+cell+death.">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li><li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS.">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420 (2013).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li><li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ade1+and+ade2+mutations+for+development+of+a+versatile+red/white+color+assay+of+amyloid-induced+oxidative+stress+in+saccharomyces+cerevisiae.">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li><li>Pallar&#232;s, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+prediction+of+protein+aggregation+propensity.">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Villar-Piqu&#233;, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation.">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li><li>Navarro, S., Villar-Piqu&#233;, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria.">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li><li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avil&#233;s, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival.">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li><li>Conchillo-Sol&#233;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGGRESCAN:+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+&amp;#34;hot+spots&amp;#34;+of+aggregation+in+polypeptides.">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &amp;#34;hot spots&amp;#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).</li><li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins.">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li><li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+prionopathies.">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li><li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress.">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li></ol>

مجموعة واسعة من أمراض ترتبط بتراكم البروتينات تجمعات في الرواسب الخلوية6،،من78،33. وقد بذلت جهود كثيرة لكشف الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى ظهور هذه الأمراض باستخدام النهج الحسابية التي لا تأخذ بعين الاعتبار تركيزات الب...

بروتيوستاسيس هو أحد المحددات أساسية لخلية عمليات الشيخوخة واللياقة البدنية. في الخلايا، والمحافظة على التوازن البروتين بمراقبة جودة البروتين المتطورة شبكات تهدف إلى ضمان ريفولدينج الصحيح لتجمعات من البروتين كونفورميرس بمرافقين و/أو بهم proteolysis المستهدفة مع عدة آليات مصانة جيدا1 ،،من23،،من45. عدد كبير من الدراسات تقديم الدعم إلى الارتباط بين ظهور وتقدم مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان وفشل بروتيوستاسيس، مما يؤدي إلى ميسفولدينج البروتين والتجميع. على سبيل المثال، وجود رواسب البروتين يعتبر علامة مميزة مرضية للعديد من اضطرابات الأعصاب، مثل الزهايمر، باركنسون، وهنتنغتون الأمراض6،7،8، أمراض بريونوجينيك، وأميلويدوسيس غير التنكسية9. يقترح أن أوائل الجمعيات أوليجوميريك وبروتوفيبريلار في رد فعل التجميع هي اليسيتورس الرئيسية من سيتوتوكسيسيتي، إقامة التفاعلات الشاذة مع غيرها من البروتينات في الوسط الخلوي مزدحمة10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينتقل البروتين تضمينات (PI) بين الخلايا، ونشر11،التأثير السمي على12. ولذلك، يمكن أن يكون أن تشكيل بي قد تشكل في الواقع إليه ديتوكسيفينغ يقيد وجود الأنواع الخطرة المجمعة إلى مواقع محددة في الخلية، حيث يمكن معالجتها أو المتراكمة دون الآثار الجانبية الرئيسية 13 , 14.
القياسية في المختبر النهج البيوكيميائية قدمت أفكاراً هامة في مختلف الأنواع التي تعيش على تجميع ردود الفعل وعلى خصائص15،16. بيد أن الظروف المستخدمة في هذه الاختبارات بوضوح تختلف عن تلك التي تحدث داخل الخلية، والسؤال التالي، أهميتها الفسيولوجية. بسبب حفظ ملحوظة من المسارات الخلوية مثل مراقبة جودة البروتين، أوتوفاجي، أو تنظيم17،الدولة الأكسدة الخلوية18 بين حقيقيات النوى19،20،21 ،،من2223، برز مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) كنموذج خلوية بسيطة متميز لدراسة محددات الجزيئية لتجميع البروتين وآثارها السامة للخلايا المرتبطة بها في البيئات ذات الصلة بيولوجيا24،،من2526.
الميل تجميع البروتين سمة ترميز أصلاً في التسلسل الرئيسي. وهكذا، يمكن التنبؤ تشكيل هياكل مثل اميلويد استناداً إلى تحديد وتقييم الفاعلية لتعزيز تجميع المناطق البروتينية27. ومع ذلك، رغم نجاح خوارزميات بيوينفورماتيك للتنبؤ بخصائص التجميع في المختبر لتسلسل البروتين، هم لا تزال أبعد ما تكون عن التنبؤ بكيفية ترجمة هذه الميول في فيفو تأثير السامة للخلايا. قد تساعد الدراسات التي تتناول العلاقة بين الدولة مجمعة بروتين معين وعن الأضرار الخلوية المرتبطة بها بطريقة منهجية للالتفاف حول هذا القيد الحسابي. تناولت هذه الدراسة، مع استفادة مجموعة كبيرة من المتغيرات من بيتا اميلويد الببتيد Aβ42 متباينة في رواسب واحد فقط، ولكن عرض نطاق متواصل من تجميع المزيف في فيفو28هذا الاتصال. على وجه الخصوص، يرد وصف لنهج القائم على التيسير لتحديد الأنواع conformational المحاسبة لأضرار الأكسدة بالبروتينات المعرضة للتجميع في خلايا الخميرة. المنهجية التي توفر العديد من المزايا مثل البساطة والقدرة الإنتاجية العالية، والقياس الكمي الدقيق. مكن هذا النهج لتأكيد أن تلعب بي بدور وقائي ضد الأكسدة.

<table><tbody><tr><td>Yeast cells BY4741&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>Genotype: MATa his3&amp;Delta;1 leu2&amp;Delta;0 met15&amp;Delta;0 ura3&amp;Delta;0</td></tr><tr><td>pESC(-Ura) plasmid&amp;nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3</td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991&amp;nbsp;</td><td>Solution 10X</td></tr><tr><td>CellROX Deep Red Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Y-PER protein extraction reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>Liquid cell lysis buffer</td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Bradford dye reagent</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>5000205</td><td>Dye reagent for one-step determination of protein concentration</td></tr><tr><td>&amp;beta;-amyloid antibody 6E10&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol</td></tr><tr><td>FACSCanto flow cytometer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>657338</td><td>Equipped with a 488&amp;nbsp;nm blue laser for the detection of GFP, and 635&amp;nbsp;nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>Protein transference system</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>Electrophoresis system</td></tr></tbody></table>

evaluation of the impact of protein aggregation on cellular oxidative stress in yeast

تم المتعلقة بالبروتين ميسفولدينج والتجميع في والتشكلات اميلويد إلى ظهور وتطور العديد من الأمراض الأعصاب. ومع ذلك، لا يزال هناك القليل من المعلومات حول بروتين غير قابل للذوبان كيف تمارس المجاميع التأثيرات السمية في فيفو. بسيطة بدائية وحقيقية النواة نموذج الكائنات، مثل البكتيريا والخميرة، ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي للآليات وراء تشكيل اميلويد داخل الخلايا وإكثار المجاميع، وسمية. في هذا البروتوكول، وهو وصف استخدام الخميرة كنموذج تشريح العلاقة بين تشكيل المجاميع البروتين وأثرها على الأكسدة الخلوية. الأسلوب يجمع بين الكشف عن الدولة القابلة للذوبان أو تجميعها داخل الخلايا بروتين أميلويدوجينيك مع التقدير الكمي للأضرار الأكسدة الخلوية الناتجة عن التعبير عن استخدام التدفق الخلوي (FC). وهذا النهج بسيطة وسريعة، والكمية. وتوضح الدراسة التقنية طريق مضاهاة الأكسدة الخلوية الناتجة عن مجموعة كبيرة من بيتا اميلويد الببتيد المتغيرات مع ميول التجميع الجوهرية الخاصة بهم.

ويصف هذا البروتوكول كيفية توظيف مجموعة من المتغيرات 20 من الببتيد Aβ42 حيث قد تم تحور Phe19 إلى جميع الأحماض الأمينية الطبيعية قائمة28. يمكن تحليل ميول التراكم النظري لهذه البروتينات باستخدام اثنين من خوارزميات مختلفة بيوينفورماتيك (أجريسكان ورقصة التانغو من<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast at JoVE.com

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

تجميع البروتين يتسبب الأكسدة الخلوية. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لرصد الدول داخل الخلايا من البروتينات أميلويدوجينيك والأكسدة المرتبطة بها، باستخدام التدفق الخلوي. يتم استخدام النهج لدراسة سلوك المتغيرات القابلة للذوبان والمعرضة للتجميع من الببتيد اميلويد بيتا.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. تجميع البروتين يتسبب الأكسدة الخلوية. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لرصد الدول داخل الخلايا من البروتينات أميلويدوجينيك والأكسدة المرتبطة بها، باستخدام التدفق الخلوي. يتم استخدام النهج لدراسة سلوك المتغيرات القابلة للذوبان والمعرضة للتجميع من الببتيد اميلويد ب?...

Video: Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein aggregation. The accumulation of protein aggregates in bacterial cells can lead to significant alterations in the cellular phenotypic behavior, including a reduction in growth rates, stress resistance, and virulence. Several experimental procedures exist for the examination of these stressor-mediated phenotypes. This paper describes an optimized assay for the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from different Escherichia coli strains after treatment with a silver-ruthenium-containing antimicrobial. This compound is known to generate reactive oxygen species and causes widespread protein aggregation. 
The method combines a centrifugation-based separation of protein aggregates and soluble proteins from treated and untreated cells with subsequent separation and visualization by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie staining. This approach is simple, fast, and allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in different E. coli strains. The methodology has a wide range of applications, including the possibility to investigate the impact of other proteotoxic antimicrobials on in vivo protein aggregation in a wide range of bacteria. Moreover, the protocol can be used to identify genes that contribute to increased resistance to proteotoxic substances. Gel bands can be used for the subsequent identification of proteins that are particularly prone to aggregation.

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

This protocol describes the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from Escherichia coli after treatment with a proteotoxic antimicrobial. Following this procedure allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in vivo in different bacterial strains and/or between treatments.

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biology

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في

عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow