هذه الطريقة توضح معايرة كمي كمية البروتين في عينة سائلة مع عملية جزيء واحد للعد. على وجه التحديد، فإنه يمكن توضيح كيف يمكن تسمية السكان البروتين fluorescently في كل مستوى الجزيء. الأساليب السابقة إجراء قياسات السائبة لتحليل نسب الضروس من الفلورسنت والبروتين الجزيئات، لكنها لا يمكن أن تكشف عن كيفية السكان البروتين غير متجانسة هي في الواقع المسمى.
يمكن أن أساليبنا تفعل ذلك مباشرة على مستوى جزيء واحد. يمكن تمديد طريقتنا نحو مقايسات التركيز الجزيئية فائقة الحساسية والمتقدمة ، والتي ستؤدي إلى طرق تشخيصية مستقبلية ، مما يسمح بالعثور على نتائج فعالة للجزيئات المسببة للأمراض في العينات. يمكن تطبيق طريقتنا على تحليل أنواع البروتين المفرد باستخدام الأجسام المضادة للفلورسنت ، بالإضافة إلى تحليل الأنواع المتعددة باستخدام ملصقات غير محددة لجميع البروتينات التي تفصلها الكهرباء أو الكروماتوغرافية.
النقطة الأكثر أهمية من هذه التقنية هو الحصول على إعادة إنتاج البيانات. أوصي بالحفاظ على نفس الحالة التجريبية قدر الإمكان عند قياس عينات متعددة. سوف العرض التوضيحي البصري لهذه التقنية توفير كيفية جعل كل خطوة تجريبية مستقرة وقابلة للتكرار.
وسوف تظهر أيضا بعض الخطوات غير المألوف في بروتوكولات الكيمياء الحيوية، مثل طلاء تدور وغسل الأغطية المجهر. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد المخزن المؤقت lysing و 1٪ Tween-20 كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدام هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة اله PH إلى 12.
مزيج 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت lysing مع ميكرولتر واحد من د.د.ت الضرس واحد وأربعة ميكرولترات من 50٪ CHAPS. إضافة ميكرولتر واحد من ثقافة الخلية المعدة والتجانس الحل عن طريق الأنابيب بطيئة لتجنب فقاعات. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع التحريض لطيف.
ثم، rehomogenize الحل عن طريق الأنابيب عليه صعودا وهبوطا ببطء. إضافة ميكروغرام واحد من Cy3 NHS صبغ استر وتجانس الحل عن طريق إبطاء الأنابيب لتجنب فقاعات. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع التحريض لطيف.
كرر هذه العملية، وإضافة نفس الكمية من الصبغة واحتضان العينة مرة واحدة. إضافة 100 ميكرولترات من 0.8 الهضاب هيبيس الصوديوم هيدروكسيد لضبط درجة الهرة من الحل إلى 7.2 وإخماد رد الفعل. ماصة ببطء صعودا وهبوطا لتجانس الحل.
بعد ذلك، إضافة 20 ميكرولترات من البيوتين-2-أمين وخمسة ميكرولترات من EDC. التجانس الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ببطء. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف.
بعد ذلك، استخدم عمود الترشيح الفائق مع قطع 10 كيلو دالتون لإزالة أي الكواشف وضع غير منقحة والتركيز على العينة. بعد أداء معيار SDS-PAGE لعينة البروتين وسلم الجزيئية، صورة هلام لتحديد موقع نطاقات البروتين. استخدام شفرة حادة لقطع أجزاء هلام التي تشمل كسور البروتين من الفائدة على أساس bands'locations.
أولاً، تحدد أغطية الأغطية التي يبلغ 22 ملليمتراً منها 22 ملليمتراً وسمكها 0.15 ملليمتراً. استخدام منظف البلازما لفضح أغطية لبقماة الهواء لمدة دقيقة واحدة لتنظيف وتنشيط الأسطح. المقبل، واستخدام معطف تدور لتدور معطف الأغطية مع 200 ميكروليتر من العازلة avadin لمدة خمس ثوان في 500RPM، تليها 30 ثانية في 1000RPM.
احتضان الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح لهم بجفاف الهواء. لإعداد الأغطية لعينة البروتين، استخدم عينة بروتين تم تخفيفها. ضع 100 ميكرولترات من العينة المخففة على وسط الأغطية المغلفة ب avadin.
احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لإعداد السيطرة الإيجابية، ضع 100 ميكرولترات من البيوتين الفلورسنت المنقى في خمسة هيدروكسيد الصوديوم HEPES ميكرومولار في 7.2 من الدرجة المئوية في وسط غطاء مغطى مغطى ب avadin. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
لإعداد التحكم السلبي ، تدور غطاء البلازما معطف مع 200 ميكرولتر من خمسة هيدروكسيد الصوديوم HEPES مع اثنين ملليغرام لكل ملليلتر من BSA دون avadin. أضف 100 ميكرولترات إلى البيوتين الفلورسنت المنقى في خمسة هيدروكسيد الصوديوم HEPES-micromolar في 7.2 من الفلورسنت. احتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد هذا، شطف كل غطاء مع 200 ميكرولترات من الماء المقطر عن طريق الأنابيب على حواف، مع التأكد من عدم لمس منتصف الغطاء مع طرف ماصة. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات. ثم، يعرض عددًا متساويًا من الأغطية الجديدة إلى بلازما الهواء لمدة دقيقة واحدة.
ضع غطاءً نظيفاً على رأس كل غطاء منضم للعينة لتجنب التجفيف. بدء تشغيل مجهر الفلورانس الحقل واسعة أو مبشر. تعيين غطاء على المجهر والعثور على التركيز.
ثم قم بإجراء مسح تجانب للحصول على صور 100 على الأقل. في هذه الدراسة، يتم تحديد التجانس المسمى لكل أنواع البروتين المسمى في الخلايا كميا بعد الانفصال مع SDS-PAGE. بيانات الصورة الخام لكسور مختلفة الوزن الجزيئي للبروتينات من خلية HeLa lysate ، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية ، وينظر هنا.
في حين أن كل من عينة البروتين والسيطرة الإيجابية معرض بين 100 و 500 البقع في الصورة الواحدة، والسيطرة السلبية معارض قليلة جدا إلى لا شيء. وهذا يدل على أن العملية تمنع بما فيه الكفاية غير محددة ملزمة من الأصباغ إلى سطح غطاء. تمثل مخططات الرسم البياني كثافة البقعة لعينات البروتين والتحكم الإيجابي قمم متعددة، والتي تمثل الربط العشوائي للصبغات إلى الأمينات الأولية في البروتينات وهياكل رباعية avadin على التوالي.
وأظهرت جميع البقع وامض وphotobleaching متدرج مع الإثارة الليزر المستمر، وتسليط الضوء على الملاحظة على مستوى جزيء واحد. ثم يتم حساب الشغل وضع العلامات، أو LO، من نسبة عدد البقع في كل عينة من البروتين إلى تلك الموجودة في عنصر التحكم الإيجابي. و LO قياس من خلية HeLa lysate عينة يتراوح من 50٪ لأصغر جزء الوزن الجزيئي، إلى 90٪ لكسور الوزن الجزيئي أعلى.
وينظر إلى LO لعينة كاملة من البروتيوم دون فصل لتكون 72٪ من المهم استخدام الكواشف الطازجة وتجنب أي غبار، وخاصة أثناء إعداد الأغطية. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل عد جزيء واحد في حجم معين لتحديد تركيزات كل بروتين. على سبيل المثال، يمكن إجراء تحليل على أي منتج خام، أو منتجات جل وكهربائية كهربائية.
هذه التقنية تمهد الطريق لاستخدام جزيء واحد التصوير fluorescence للطب الجزيئي، والكيمياء العضوية، وتحليل omics. عن طريق سد المفهوم بين التركيز والأرقام. هيدروكسيد الصوديوم المركز هو تآكل، وينبغي ارتداء الحماية الكافية عند التعامل معها.
أيضا، يمكن أن يسبب ارتفاع الطاقة أشعة الليزر تلف العين، لذلك قد يتم ارتداء نظارات واقية.
