Bu yöntem, sıvı numunede protein miktarının sayısallaştırılmasının tek moleküllü proses ile sayma için kalibrasyonunu göstermektedir. Özellikle, protein popülasyonlarının her molekül seviyesinde floresan olarak nasıl etiketlenebileceğini gösterebiliyor. Daha önceki yöntemler floresan ve protein moleküllerinin molar oranlarını analiz etmek için toplu ölçümler yapmış, ancak protein popülasyonlarının gerçekte ne kadar heterojen olarak etiketlendiğini ortaya çıkaramamaktadır.
Yöntemlerimiz bunu doğrudan tek molekül seviyesinde yapabilir. Yöntemimiz, numunelerde patojenik moleküllerin verimli bulgularına olanak sağlayacak, gelecekteki tanı yöntemlerine yol açacak olan ultra duyarlı ve gelişmiş moleküler konsantrasyon tahlillerine doğru genişletilebilir. Yöntemimiz floresan antikorlar kullanılarak tek protein türleri analizine ve elektroforez veya kromatografi ile ayrılan tüm proteinler için spesifik olmayan etiketler kullanılarak birden fazla tür analizine uygulanabilir.
Tekniğin en kritik noktası veri tekrarlanabilirliği elde etmektir. Birden fazla örneği ölçerken aynı deneysel durumu mümkün olduğunca korumanızı öneririm. Bu tekniğin görsel gösterimi, her deneysel adımın kararlı ve tekrarlanabilir hale getirilen nasıl sağlanacaktır.
Ayrıca, mikroskop kapaklarının spin kaplaması ve yıkanması gibi biyokimya protokollerinde de nadir bir adım olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi lysing tampon ve%1 Tween-20'yi hazırlayın. pH'ı 12'ye ayarlamak için sodyum hidroksit kullanın.
100 mikrolitre lysing tamponu ile bir molar DDT mikrolitresini ve dört mikrolitre %50 CHAPS'yi karıştırın. Hazırlanan hücre kültürünün bir mikrolitre ekleyin ve kabarcıklar önlemek için yavaş pipetleme tarafından çözelti homojenize. Hafif ajitasyon ile beş dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.
Daha sonra, yavaş yavaş yukarı ve aşağı borulama tarafından çözelti rehomojenize. Cy3 NHS ester boya bir mikrogram ekleyin ve kabarcıklar önlemek için pipetleme yavaşlatarak çözelti homojenize. Hafif ajitasyon ile 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.
Aynı miktarda boya ekleyerek ve numuneyi bir kez kuluçkaya yatırarak bu işlemi tekrarlayın. Çözeltinin pH'ını 7,2'ye ayarlamak ve reaksiyonu gidermek için 100 mikrolitre 0,8 molar HEPES-sodyum hidroksit ekleyin. Çözeltiyi homojenize etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet.
Sonra, Biotin-2-amin ve EDC beş mikrolitre 20 mikrolitre ekleyin. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı borular oluşturarak çözeltiyi homojenize edin. Hafif ajitasyon ile bir saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.
Bundan sonra, tepkisiz etiketleme reaktiflerini çıkarmak ve numuneyi yoğunolarak konsantre etmek için 10 kiloDalton kesme ile ultrafiltrasyon sütunu kullanın. Protein numunesi ve moleküler merdiven için standart SDS-PAGE yaptıktan sonra, protein bantlarının yerini belirlemek için jeli görüntüleyin. Bantların konumlarına göre protein fraksiyonları içeren jel kısımlarını kesmek için keskin bir bıçak kullanın.
İlk olarak, 22 milimetre tarafından 22 milimetre ve 0.15 milimetre kalınlığında kapakları dışarı ayarlayın. Yüzeylerini temizlemek ve etkinleştirmek için kapakları hava plazmasına bir dakika lığına maruz bırakmak için bir plazma temizleyicikullanın. Daha sonra, 500RPM beş saniye için avadin tampon 200 mikrolitre ile coverlips spin için bir spin coater kullanın, 1000RPM 30 saniye takip.
Kapak dudaklarını oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırArak havanın kurumasını bekleyin. Protein örneği için kapak lar hazırlamak için seyreltilmiş bir protein örneği kullanın. Seyreltilmiş numunenin 100 mikrolitresini avadin kaplı kapakların ortasına yerleştirin.
15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Pozitif kontrolü hazırlamak için, pH 7.2'de beş mikromolar HEPES-sodyum hidroksite 100 mikrolitre saflaştırılmış floresan biyotin yerleştirin. 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.
Negatif kontrolü hazırlamak için spin coat plazma, avadin olmadan mililitre başına iki miligram olan beş HEPES-sodyum hidroksitin 200 mikrolitresi ile kapakları kapsamaktadır. PH 7.2'de beş mikromolar HEPES-sodyum hidroksitte saflaştırılmış floresan biyotine 100 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika karanlıkta kuluçkaya yat.
Bundan sonra, her coverslip'i 200 mikrolitre distile su ile durulayın, kenarlarında borular ile tutarak, pipet ucuyla kapak kaymanın ortasına dokunmamaya özen. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Daha sonra, bir dakika lığına eşit sayıda yeni kapak dudakını hava plazmasına maruz bırakın.
Kurumasını önlemek için numuneye bağlı her kapak lı nın üzerine temizlenmiş bir kapak fişi yerleştirin. Geniş alan veya evanescent alan floresan mikroskobu başlatın. Mikroskoba bir kapak kayması ayarlayın ve odak noktasını bulun.
Ardından, en az 100 görüntü elde etmek için bir döşeme tayini gerçekleştirin. Bu çalışmada, hücrelerde etiketlenmiş her protein türünün etiketleme homojenliği SDS-PAGE ile ayrıldıktan sonra ölçüldü. HeLa hücre lisatından proteinlerin farklı molekül ağırlıklı fraksiyonlarının ham görüntü verilerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de burada görülmektedir.
Hem protein örneği hem de pozitif kontrol görüntü başına 100 ile 500 nokta arasında sergilenirken, negatif kontrol çok az ıstabiri yok. Bu, sürecin boyaların kapak yüzeyine spesifik olmayan bağlanmasını yeterince engellediğini gösterir. Protein örnekleri ve pozitif kontrol için spot yoğunluklu histogramlar, boyaların proteinlerdeki primer aminlere ve avadin tetramer yapılarına stokstik bağlanmasını temsil eden birden fazla tepe yi tir.
Tüm noktalar sürekli lazer uyarma ile yanıp sönen ve adım adım fotobeyazlatma gösterdi, tek molekül düzeyinde gözlem vurgulayarak. Etiketleme doluluk, ya da LO, daha sonra pozitif kontrol de her protein örnekleke lerinin oranı hesaplanır. HELa hücreli lysate numunesinden ölçülen LO, daha küçük molekül ağırlık fraksiyonu için %50 ile daha yüksek molekül ağırlık fraksiyonu için %90 arasında değişmektedir.
Tüm proteom numunesinin ayrıştırılmadan LO'su %72 olarak görülür Özellikle kapak kapaklarının hazırlanması sırasında taze yapılmış reaktiflerin kullanılması ve tozdan kaçınmak önemlidir. Bu işlemden sonra, her proteinin konsantrasyonlarını ölçmek için belirli bir hacimde tek molekül sayma analizi yapılabilir. Örneğin, herhangi bir ham ürün veya jel ve kılcal elektroforez ürünleri üzerinde analiz yapılabilir.
Bu teknik, tek moleküllü floresan görüntülemenin moleküler tıp, organik kimya ve omik analizine kullanılmasının önünü açar. Konsantrasyon ve sayılar arasındaki kavramı birleştirerek. Konsantre sodyum hidroksit aşındırıcıdır ve kullanım sırasında yeterli koruma takılmalıdır.
Ayrıca, yüksek güçlü lazer radyasyongöz hasarına neden olabilir, bu yüzden koruyucu gözlük takılabilir.
