이 방법은 계수를 위한 단일 분자 공정을 가진 액체 견본에 있는 단백질 양을 정량화의 보정을 보여줍니다. 특히, 단백질 인구가 각 분자 수준에서 형광으로 표시될 수 있는 방법을 설명할 수 있습니다. 이전 방법은 형광 및 단백질 분자의 어금니 비율을 분석하기 위해 대량 측정을 수행했지만 이질적으로 단백질 인구가 실제로 어떻게 표지되는지 밝힐 수 없습니다.
우리의 방법은 단일 분자 수준에서 직접 할 수 있습니다. 우리의 방법은 표본에 있는 병원성 분자의 능률적인 사실 인정을 허용하는 미래 진단 방법으로 이끌어 낼 초감도및 향상된 분자 농도 assays를 향해 확장될 수 있습니다. 우리의 방법은 형광 항체를 이용한 단일 단백질 종 분석뿐만 아니라 전기 전구 또는 크로마토그래피로 분리된 모든 단백질에 대한 비특이적 라벨을 사용하여 다중 종 분석에 적용될 수 있습니다.
이 기술의 가장 중요한 점은 데이터 재현성을 얻는 것입니다. 여러 샘플을 측정할 때 가능한 한 동일한 실험 상태를 유지하는 것이 좋습니다. 이 기술의 시각적 데모는 각 실험 단계를 안정적이고 재현 가능하게 만드는 방법을 제공합니다.
또한 현미경 커버립의 스핀 코팅 및 세척과 같은 생화학 프로토콜에서 몇 가지 드문 단계를 보여줄 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액 버퍼와 1%Tween-20을 준비합니다. 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 12로 조정합니다.
1개의 어금니 DDT의 마이크로리터 1개, 50%CHAPS의 4개의 마이크로리터와 100마이크로리터의 리싱 버퍼를 섞는다. 준비된 세포 배양의 마이크로리터 1개를 추가하고 거품을 피하기 위해 느린 파이펫팅으로 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요와 함께 실온에서 5 분 동안 어둠 속에서 배양.
그런 다음, 천천히 위아래로 파이프하여 용액을 다시 호질화. Cy3 NHS 에스테르 염료 1 마이크로그램을 추가하고 거품을 피하기 위해 파이프팅을 느리게하여 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요로 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
이 과정을 반복하여 동일한 양의 염료를 추가하고 샘플을 한 번 배양합니다. 용액의 pH를 7.2로 조정하고 반응을 담금질하기 위해 0.8 개의 어금니 HEPES-수산화 나트륨의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 용액을 균질화하기 위해 위아래로 천천히 파이펫을 합니다.
다음으로, 비오틴-2-아민 2-아민의 마이크로리터 20개와 EDC 5마이크로리터를 추가합니다. 천천히 위아래로 피펫을 하여 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요와 실온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양.
그 후 10킬로달톤 컷오프가 있는 초여열을 사용하여 반응되지 않은 라벨링 시약을 제거하고 시료를 농축합니다. 단백질 샘플 및 분자 사다리에 대한 표준 SDS-PAGE를 수행한 후, 젤을 이미지하여 단백질 밴드의 위치를 식별한다. 날카로운 블레이드를 사용하여 밴드의 위치에 따라 관심있는 단백질 분수를 포함하는 젤 부분을 잘라냅니다.
먼저 22mm x 22밀리미터, 두께0.15밀리미터의 커버립을 설정합니다. 플라즈마 클리너를 사용하여 커버립을 공기 플라즈마에 1분 동안 노출하여 표면을 청소하고 활성화합니다. 다음으로 스핀 코터를 사용하여 500RPM에서 5초 동안 200 마이크로리터의 아바딘 버퍼로 커버립을 코팅하고 1000RPM에서 30초가 됩니다.
커버립을 실온에서 15분간 배양하여 공기가 건조해질 수 있도록 합니다. 단백질 샘플을 위한 커버립을 준비하려면 희석된 단백질 샘플을 사용하십시오. 희석된 시료 100마이크로리터를 아바딘 코팅 커버립의 중앙에 놓습니다.
실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 양성 조절을 준비하려면 정제형 형광 비오틴 100마이크로리터를 5개의 마이크로몰라 HEPES-수산화나트륨에 pH 7.2의 중앙에 배치하여 아바딘 코팅 커버슬립의 중심에 놓습니다. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요.
음의 대조를 준비하기 위해 스핀 코트 플라즈마 커버립5 HEPES-나트륨 수산화기의 200 마이크로 리터와 아바딘없이 BSA의 밀리리터 당 2 밀리그램. pH 7.2에서 5개의 마이크로몰라 HEPES-나트륨 수산화제에 100마이크로리터를 정제형 형광 바이오틴에 첨가하십시오. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
그 후, 각 커버슬립을 가장자리에 파이펫으로 200 마이크로리터의 증류수를 헹구고 파이펫 팁으로 커버슬립의 중간을 만지지 않도록 하십시오. 이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 1 분 동안 공기 플라즈마에 동일한 수의 새로운 커버립을 노출하십시오.
건조를 피하기 위해 각 샘플 바인딩 커버슬립 위에 청소된 커버슬립을 놓습니다. 넓은 필드 또는 에반에센트 필드 형광 현미경을 시작합니다. 현미경에 커버 슬립을 설정하고 초점을 찾을 수 있습니다.
그런 다음 타일 스캔을 수행하여 최소 100개의 이미지를 얻습니다. 이 연구에서는, 세포에 있는 각 표지된 단백질 종의 표기 균질성은 SDS-PAGE로 분리 한 후에 정량화됩니다. HeLa 세포 용해에서 단백질의 다른 분자량 분획뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 대조군을 위한 원시 이미지 데이터는 여기에서 볼 수 있습니다.
단백질 샘플과 양성 대조군 모두 이미지당 100~500개의 반점을 나타내지만, 음의 대조는 거의 없는 것으로 나타낸다. 이것은 프로세스가 커버 슬립 표면에 염료의 비특이적 결합을 충분히 억제한다는 것을 보여줍니다. 단백질 샘플과 양성 제어를 위한 반점 강도 히스토그램은 각각 단백질 및 아바딘 테트라머 구조의 1차 아민에 염료의 야상적 결합을 나타내는 여러 봉우리를 제시한다.
모든 반점은 연속 레이저 여기와 깜박임과 단계별 광표백을 보여 주었다, 단일 분자 수준에서 관찰을 강조. 라벨링 점유, 또는 LO는, 그 때 양성 대조군에서 모든 단백질 샘플에 있는 반점의 수의 비율에서 계산됩니다. HeLa 세포 용해 샘플에서 측정된 LO는 더 작은 분자량 분획의 경우 50%에서 더 높은 분자량 분획의 경우 90%까지 다양합니다.
분리가 없는 전체 프로테오메 시료에 대한 LO는 72%로 볼 수 있으며, 특히 커버립을 준비하는 동안 갓 만든 시약을 사용하고 먼지를 피하는 것이 중요하다. 이 절차에 따라, 특정 부피에서 단일 분자 계수 분석은 각 단백질의 농도를 정량화하기 위해 수행 될 수있다. 예를 들어, 임의의 원료 제품, 또는 겔 및 모세관 전기포고염 제품에 대한 분석은 수행될 수 있다.
이 기술은 분자 의학, 유기 화학 및 omics 분석에 단 하나 분자 형광 화상 진찰을 이용하기 위한 도로를 포장합니다. 농도와 숫자 사이의 개념을 연결하는 것입니다. 농축 된 수산화 나트륨은 부식성이며, 그것을 취급할 때 적절한 보호가 착용되어야합니다.
또한, 고출력 레이저 방사선은 눈 손상을 일으킬 수 있으므로 보호 고글을 착용 할 수 있습니다.
