Diese Methode demonstriert die Kalibrierung der Quantifizierung der Proteinmenge in flüssigen Proben mit einem Einzelmolekülverfahren zum Zählen. Insbesondere kann es veranschaulichen, wie Proteinpopulationen auf jeder Molekülebene fluoreszierend gekennzeichnet werden können. Frühere Methoden führten Massenmessungen durch, um molare Verhältnisse von fluoreszierenden und Proteinmolekülen zu analysieren, aber sie können nicht aufzeigen, wie heterogen Proteinpopulationen tatsächlich gekennzeichnet sind.
Unsere Methoden können es direkt auf der Einmolekülebene tun. Unsere Methode kann auf ultrasensible und fortgeschrittene molekulare Konzentrationstests ausgedehnt werden, was zu zukünftigen diagnostischen Methoden führen wird, die effiziente Ergebnisse pathogener Moleküle in Proben ermöglichen. Unsere Methode kann auf die Analyse einzelner Proteinarten mit fluoreszierenden Antikörpern sowie auf die Analyse mehrerer Arten mit unspezifischen Etiketten für alle durch Elektrophorese oder Chromatographie getrennten Proteine angewendet werden.
Der kritischste Punkt der Technik ist die Reproduzierbarkeit von Daten. Ich empfehle, den gleichen experimentellen Zustand so weit wie möglich bei der Messung mehrerer Proben zu halten. Die visuelle Demonstration dieser Technik wird zeigen, wie jeder experimentelle Schritt stabil und reproduzierbar wird.
Es wird auch einige ungewöhnliche Schritte in der Biochemie Protokolle zeigen, wie die Spin-Beschichtung und Waschen von Mikroskop Abdeckungen. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens den Lysingpuffer und 1%Tween-20 wie im Textprotokoll beschrieben vor. Verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 12 einzustellen.
Mischen Sie 100 Mikroliter Lysingpuffer mit einem Mikroliter eines Molaren DDT und vier Mikroliter 50%CHAPS. Fügen Sie einen Mikroliter der vorbereiteten Zellkultur hinzu und homogenisieren Sie die Lösung durch langsames Pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit sanfter Rührung.
Rehomogenisieren Sie dann die Lösung, indem Sie sie langsam nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie ein Mikrogramm Cy3 NHS EsterFarbstoff hinzu und homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie die Pipettierung verlangsamen, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit sanfter Rührung.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die gleiche Menge Farbstoff hinzufügen und die Probe einmal inkubieren. Fügen Sie 100 Mikroliter 0,8 Mol HEPES-Natriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung auf 7,2 einzustellen und die Reaktion zu löschen. Langsam Pipetten nach oben und unten, um die Lösung zu homogenisieren.
Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter Biotin-2-Amin und fünf Mikroliter EDC hinzu. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde mit sanfter Rührung.
Verwenden Sie danach eine Ultrafiltrationssäule mit einem 10-Kilo-Dalton-Cutoff, um unreagierte Etikettierungsreagenzien zu entfernen und die Probe zu konzentrieren. Nach der Ausführung von Standard-SDS-PAGE für die Proteinprobe und einer molekularen Leiter, bilde das Gel ab, um die Position der Proteinbänder zu identifizieren. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um die Gelportionen auszuschneiden, die Proteinfraktionen enthalten, die auf den Standorten der Bänder basieren.
Legen Sie zunächst Abdeckungen fest, die 22 mal 22 Millimeter groß und 0,15 Millimeter dick sind. Verwenden Sie einen Plasmareiniger, um die Abdeckungen für eine Minute dem Luftplasma auszusetzen, um ihre Oberflächen zu reinigen und zu aktivieren. Als nächstes verwenden Sie einen Spin Coater, um die Abdeckungen mit 200 Mikroliter Avadin-Puffer für fünf Sekunden bei 500RPM zu schichten, gefolgt von 30 Sekunden bei 1000U/min.
Inkubieren Sie die Abdeckungen bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um sie an der Luft trocknen zu lassen. Verwenden Sie zur Herstellung von Coverlips für die Proteinprobe eine Proteinprobe, die verdünnt wurde. 100 Mikroliter der verdünnten Probe auf die Mitte der avadinbeschichteten Abdeckungen legen.
Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Zur Vorbereitung der Positivkontrolle 100 Mikroliter gereinigtes fluoreszierendes Biotin in fünf mikromolareHEPES-Natriumhydroxid bei pH 7,2 in die Mitte eines avadinbeschichteten Abdeckrutsches geben. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
Zur Vorbereitung der Negativkontrolle, Spin-Schicht-Plasma Abdeckungenmitlipsmitlips mit 200 Mikroliter von fünf HEPES-Natriumhydroxid mit zwei Milligramm pro Milliliter BSA ohne Avadin. Fügen Sie 100 Mikroliter zu gereinigtem fluoreszierendem Biotin in fünf mikromolarem HEPES-Natriumhydroxid bei pH 7,2 hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Danach spülen Sie jeden Deckelschlupf mit 200 Mikroliter destilliertem Wasser durch Pipettieren an den Rändern, um sicherzustellen, dass die Mitte des Deckels nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Setzen Sie dann eine Minute lang eine gleiche Anzahl neuer Abdeckungen dem Luftplasma aus.
Legen Sie einen gereinigten Deckelaufschlag auf jeden probengebundenen Deckel, um eine Trocknung zu vermeiden. Starten Sie ein Weitfeld- oder Evaneszenzfluoreszenzmikroskop. Stellen Sie einen Deckelschlupf auf das Mikroskop und finden Sie den Fokus.
Führen Sie dann einen Kachelscan durch, um mindestens 100 Bilder zu erhalten. In dieser Studie wird die Kennzeichnungshomogenität jeder markierten Proteinart in Zellen nach Trennung mit SDS-PAGE quantifiziert. Die Rohbilddaten für verschiedene Molekulargewichtsfraktionen von Proteinen aus HeLa-Zelllysat sowie die positiven und negativen Kontrollen sind hier zu sehen.
Während sowohl die Proteinprobe als auch die Positivkontrolle zwischen 100 und 500 Flecken pro Bild aufweisen, weist die Negativkontrolle nur sehr wenige bis gar keine auf. Dies zeigt, dass der Prozess die unspezifische Bindung von Farbstoffen an die Deckgerade ausreichend hemmt. Spot-Intensitätshistogramme für die Proteinproben und die Positivkontrolle stellen mehrere Spitzen dar, die die stochastische Bindung von Farbstoffen an primäre Amen in Proteinen bzw. Avadin-Tetramerstrukturen darstellen.
Alle Flecken zeigten blinkendes und stufenweises Photobleaching mit kontinuierlicher Lasererregung, wobei die Beobachtung auf der Ebene des einzelnen Moleküls hervorgehoben wurde. Die Etikettierungsbelegung oder LO wird dann aus dem Verhältnis der Anzahl der Flecken in jeder Proteinprobe zu dem in der Positivkontrolle berechnet. Die aus der HeLa-Zelllysatprobe gemessene LO reicht von 50 % für die kleinere Molekulargewichtsfraktion bis zu 90 % für die Fraktion mit höherem Molekulargewicht.
Die LO für die gesamte Proteomprobe ohne Trennung ist 72%Es ist wichtig, frisch hergestellte Reagenzien zu verwenden und Staub zu vermeiden, insbesondere bei der Herstellung der Deckellipsen. Nach diesem Verfahren kann eine Analyse der Einzelmolekülzählung in einem bestimmten Volumen durchgeführt werden, um die Konzentrationen jedes Proteins zu quantifizieren. Beispielsweise kann eine Analyse an jedem Rohprodukt oder Gel- und Kapillarelektrophoreseprodukten durchgeführt werden.
Diese Technik ebnet den Weg für die Verwendung von Einzelmolekülfluoreszenz-Bildgebung für molekulare Medizin, organische Chemie und Omics-Analyse. Durch überbrücken des Konzepts zwischen Konzentration und Zahlen. Konzentriertes Natriumhydroxid ist korrosiv, und bei der Handhabung sollte ein ausreichender Schutz getragen werden.
Auch Hochleistungs-Laserstrahlung kann Augenschäden verursachen, so schutzweise Brille nimmern.
