Este método demonstra a calibração da quantidade de proteína quantificada em amostra líquida com processo de molécula única para contagem. Especificamente, pode ilustrar como as populações de proteínas podem ser rotuladas fluorescentemente em cada nível de molécula. Métodos anteriores realizaram medições em massa para analisar as proporções molares de moléculas fluorescentes e proteicas, mas não podem revelar como populações heterogêneas de proteínas são realmente rotuladas.
Nossos métodos podem fazê-lo diretamente no nível de molécula única. Nosso método pode ser estendido para ensaios de concentração molecular ultrasensíveis e avançados, o que levará a métodos diagnósticos futuros, permitindo descobertas eficientes de moléculas patogênicas em espécimes. Nosso método pode ser aplicado à análise de espécies de proteínas únicas usando anticorpos fluorescentes, bem como análise de múltiplas espécies usando rótulos não específicos para todas as proteínas separadas por eletroforese ou cromatografia.
O ponto mais crítico da técnica é a obtenção da reprodutibilidade de dados. Recomendo manter a mesma condição experimental o máximo possível ao medir várias amostras. A demonstração visual desta técnica fornecerá como tornar cada passo experimental estável e reprodutível.
Também mostrará algum passo incomum nos protocolos de bioquímica, como o spin-coating e a lavagem de tampas de microscópio. Para iniciar este procedimento, prepare o buffer de 1%Tween-20 conforme descrito no protocolo de texto. Use hidróxido de sódio para ajustar o pH a 12.
Misture 100 microliters de tampão de lise com um microliter de um DDT molar e quatro microliters de 50% CHAPS. Adicione um microliter da cultura celular preparada e homogeneize a solução com tubulação lenta para evitar bolhas. Incubar no escuro à temperatura ambiente por cinco minutos com agitação suave.
Em seguida, rehomogenize a solução pipetting-lo para cima e para baixo lentamente. Adicione um micrograma de corante de éster Cy3 NHS e homogeneize a solução retardando a pipetação para evitar bolhas. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos com agitação suave.
Repita este processo, adicionando a mesma quantidade de corante e incubando a amostra uma vez. Adicione 100 microlitadores de 0,8 hidróxido molar HEPES-sódio para ajustar o pH da solução para 7,2 e para saciar a reação. Pipeta lentamente para cima e para baixo para homogeneizar a solução.
Em seguida, adicione 20 microliters de Biotin-2-amine e cinco microliters de EDC. Homogeneize a solução se escoando lentamente para cima e para baixo. Incubar no escuro à temperatura ambiente por uma hora com agitação suave.
Depois disso, use uma coluna de ultrafiltração com um corte de 10 quiloDalton para remover quaisquer reagentes de rotulagem não redigidos e concentrar a amostra. Depois de realizar sds-PAGE padrão para a amostra de proteína e uma escada molecular, imagem do gel para identificar a localização das bandas de proteína. Use uma lâmina afiada para cortar as porções de gel que incluem frações de interesse proteicas com base nas localizações das bandas.
Primeiro, defina deslizamentos de cobertura de 22 milímetros por 22 milímetros e têm 0,15 milímetros de espessura. Use um limpador de plasma para expor as tampas ao plasma de ar por um minuto para limpar e ativar suas superfícies. Em seguida, use um revestr de giro para girar as tampas com 200 microliters de tampão avadin por cinco segundos a 500RPM, seguido por 30 segundos a 1000RPM.
Incubar as tampas à temperatura ambiente por 15 minutos para deixá-las secas. Para preparar as manchas para a amostra de proteína, use uma amostra de proteína que foi diluída. Coloque 100 microliters da amostra diluída no centro das tampas revestidas de avadin.
Incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos. Para preparar o controle positivo, coloque 100 microliters de biotina fluorescente purificada em cinco hidróxido de sódio HEPES-sódio micromolar no pH 7.2 no centro de uma mancha de cobertura revestida avadin. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos.
Para preparar o controle negativo, gire as tampas de plasma com 200 microlitres de cinco hidróxido de sódio HEPES com dois miligramas por mililitro de BSA sem avadin. Adicione 100 microliters à biotina fluorescente purificada em cinco hidróxido de sódio HEPES-sódio micromolar a pH 7.2. Incubar no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente.
Depois disso, enxágue cada tampa com 200 microliters de água destilada por tubulação nas bordas, certificando-se de não tocar no meio da tampa com a ponta da pipeta. Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, exponha um número igual de novas tampas ao plasma de ar por um minuto.
Coloque uma mancha de cobertura limpa em cima de cada mancha de cobertura ligada à amostra para evitar a secagem. Inicie um microscópio de fluorescência de campo amplo ou evanescente. Coloque uma mancha de cobertura no microscópio e encontre o foco.
Em seguida, realize uma varredura de ladrilhos para obter pelo menos 100 imagens. Neste estudo, a homogeneidade de rotulagem de cada espécie de proteína rotulada nas células é quantificada após a separação com ADS-PAGE. Os dados de imagem bruta para diferentes frações de peso molecular de proteínas de lise celular HeLa, bem como os controles positivos e negativos, são vistos aqui.
Enquanto tanto a amostra de proteína quanto o controle positivo apresentam entre 100 e 500 pontos por imagem, o controle negativo apresenta muito pouco ou nenhum. Isso mostra que o processo inibe suficientemente a ligação não específica de corantes à superfície do deslizamento de tampas. Os histogramas de intensidade spot para as amostras de proteína e o controle positivo apresentam múltiplos picos, que representam a ligação estocástica de corantes às aminas primárias em proteínas e estruturas tetramer avadina, respectivamente.
Todos os pontos mostraram pisca-pisca e fotobleaching stepwise com excitação a laser contínua, destacando a observação no nível de molécula única. A ocupação da rotulagem, ou LO, é então calculada a partir da razão do número de pontos em cada amostra de proteína para a do controle positivo. A LO medida a partir da amostra de liseto celular HeLa varia de 50% para a menor fração de peso molecular, a 90% para a fração de peso molecular mais alto.
O LO para toda a amostra de proteome sem separação é visto como 72%É fundamental usar reagentes recém-feitos e evitar qualquer poeira, especialmente durante a preparação das tampas. Após este procedimento, a análise de contagem de moléculas únicas em um determinado volume pode ser realizada para quantificar as concentrações de cada proteína. Por exemplo, pode ser realizada a análise de qualquer produto bruto, ou produtos de eletroforese gel e capilar.
Esta técnica abre caminho para a utilização de imagens de fluorescência de moléculas únicas para medicina molecular, química orgânica e análise de omices. Ao fazer a ponte entre concentração e números. Hidróxido de sódio concentrado é corrosivo, e a proteção adequada deve ser usada ao manuseá-lo.
Além disso, a radiação laser de alta potência pode causar danos oculares, de modo que óculos de proteção podem ser usados.
