يمكن لهذا البروتوكول الإجابة على كيفية تنظيم الدوائر المختلفة في الدماغ لنشوء الخلايا العصبية للبالغين وعلى وجه التحديد كيف تؤثر الدوائر العصبية المحفزة أو المثبطة على انتشار الخلايا الجذعية العصبية البالغة. وميزة هذه التقنية هي أنها قادرة على استهداف الدوائر العصبية المطلوبة على وجه التحديد ، وكذلك تقليل كمية الإجهاد المقدمة للحيوانات. هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة كيف تنظم دوائر الدماغ المختلفة النشوء العصبي للبالغين ، على وجه الخصوص ، كيف أن أنواع الخلايا المحددة التي تطلق بعض الناقلات العصبية تنظم انتشار الخلايا الجذعية العصبية للبالغين.
لبدء هذا الإجراء، ضع أقسام الأنسجة في برنامج تلفزيوني وجبل خمسة إلى ثمانية أقسام على شريحة مشحونة بشكل إيجابي في ترتيب تسلسلي من الأمامي إلى الخلفي. دع أقسام الأنسجة تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق والتزم تمامًا بالشرائح. بعد ذلك، إعداد المخزن المؤقت سيترات في حاوية.
سخني العازلة السيتراتية في فرن الميكروويف لمدة خمس دقائق حتى يغلي المحلل. في غضون ذلك، ضع الأجزاء المثبتة في حامل شريحة زجاجية. بعد خمس دقائق، ضع حامل الشريحة بعناية مع المقاطع في صندوق ماصة.
تعيين قوة فرن الميكروويف إلى 50٪، ويطهى الوقت إلى سبع دقائق. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت لمدة سبع دقائق، ومراقبة الحل. أوقف فرن الميكروويف عندما يبدأ المحلل في الغليان، واستمر الميكروويف بعد توقف الغليان.
توقف بعد نفاد جهاز ضبط الوقت، حتى لو لم ينته وقت الطهي على الميكروويف. والهدف من هذه الخطوة هو الحفاظ على الماء الحق تحت درجة حرارة الغليان دون السماح للمياه يغلي بشكل مفرط. سوف الكثير من الغليان إزالة أقسام الأنسجة من الشريحة.
ثم، نقل مربع دافئ مع العازلة سيترات والشرائح الأنسجة إلى دلو الثلج للتبريد. تغطية مربع، وانتظر لمدة 30 دقيقة أو حتى الحل هو بارد لمسة، قبل الشروع في تلطيخ التناظرية thymidine. لطخة أقسام الأنسجة مع التناظرية thymidine، وإزالة أقسام الأنسجة من العازلة سترات.
اسمحوا أقسام الأنسجة الجافة والتمسك تماما الشرائح، قبل رسم الحدود مع قلم مبيد للماء. بعد ذلك، permeabilize المقاطع مع المخزن المؤقت permeabilization لمدة 20 إلى 30 دقيقة. اغسل الأقسام مرتين باستخدام TBS-triton لمدة خمس دقائق في كل مرة.
ثم قم بإعداد حل رد فعل Edu. احتضان المقاطع في حل رد فعل Edu لمدة 30 دقيقة إلى ساعة. في وقت لاحق، يغسل لهم ثلاث مرات في TBS-تريتون لمدة خمس دقائق في كل مرة.
تغطية الشرائح في رقائق الألومنيوم، أو وضعها في غرفة محمية للضوء للحماية من الضوء بعد هذه الخطوة. في هذه المرحلة، تحقق مما إذا كان رد فعل Edu يعمل باستخدام مجهر فلوري. يجب ملاحظة الخلايا التي تحمل علامة Edu إذا كان التفاعل يعمل.
الآن، منع أقسام الأنسجة المركبة باستخدام عازلة حظر التي أثيرت في نفس الحيوان مثل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة. ثم، يغسل لهم مرتين في TBS-تريتون لمدة خمس دقائق في كل مرة. أثناء خطوة الحظر، قم بإعداد حل الأجسام المضادة الأساسية عن طريق خلط الجسم المضاد الأساسي في عازلة الحظر.
في وقت لاحق، إضافة 250 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل شريحة لضمان أجزاء الأنسجة مغمورة تماما، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، غسل أقسام الأنسجة ثلاث مرات في TBS-تريتون لمدة خمس دقائق كل لإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة. ثم، احتضان أقسام الأنسجة في الأجسام المضادة الثانوية الفلورووفية المترافقة المعدة في محلول عازلة منع لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
اغسل أقسام الأنسجة ثلاث مرات في TBS-triton لمدة خمس دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. بعد ذلك، تطبيق 300-ميكرومولار DAPI حل في واحد إلى 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، غسل أقسام الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لإزالة كل من الزائدة DAPI، وإزالة دائرة القلم PAP حول الأنسجة باستخدام مسحة القطن.
السماح للأبواب الجافة، قبل تطبيق تصاعد وسائل الإعلام وتغطيتها مع الأغطية. باستخدام برنامج التصوير ، افتح صورة كل قسم gyrus دنت كصورة مركبة مع القنوات المندمجة بألوان متميزة لتصور بسهولة الكولوكية. ثم، قياس مساحة gyrus dentate في كل قسم باستخدام أداة تحديد المضلع، وتسجيل جميع المقاطع من كل ماوس.
وستكون هذه هي مساحة الجيروسكوبات الزناة المستخدمة لحساب الكثافة. باستخدام البرنامج عداد خلية البرنامج المساعد وجدت تحت الإضافات، تحليل، خلية العداد، خلية العداد، تسجيل عدد الخلايا في gyrus دنتات التي لديها الأجسام المضادة الأولية colocalizing وthymidine التناظرية إيدو من الصورة المركبة. بالإضافة إلى ذلك، قم بتسجيل العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية والإيجابية في الإهتياء في االنسج مع عملية شعاعية.
في حالة النسستين ، من المهم جدًا الانتباه إلى مورفولوجيا الخلايا. إذا كان قياس الخلايا الجذعية العصبية، تأكد من أن الخلايا فقط مع عملية شعاعية يتم تحديدها كميا. أدخل تعداد الخلايا في برنامج جدول بيانات لتجميع كافة البيانات للتحليل فيما بعد.
على سبيل المثال، للحصول على كثافة الخلايا الجذعية، قم بتقسيم مجموع الخلايا الإيجابية ال nestin و Edu-positive على مجموع حجم الجيروسكوبات في كل. حساب حجم كل مقطع بضرب المساحة مع إجمالي الزيادات الخطوة Z، على افتراض أن كل خطوة هو ميكرومتر واحد. في هذا البروتوكول، يجب أن تكون الخطوات الإجمالية قريبة من 40 منذ يتم تقسيم الأنسجة في 40 ميكرومتر.
في وقت لاحق، حساب العدد الإجمالي للخلايا المتكاثرة، في المئة من الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة، والخلايا المتكاثرة الكلية بعد تحفيز الخلايا الطحلبية المقابلة. باستخدام thymidine thymidine التناظرية إيدو واسترجاع المستضد لتلطي البقعة nestin، تم تصنيف الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة بنجاح. بالإضافة إلى ذلك، من خلال حذف خطوة استرجاع المستضد، تم تسمية السلف العصبي الإيجابي Tbr2 واعصاب الخلايا العصبية العصبية والخلايا العصبية غير الناضجة.
هنا مثال على المساحة التي تم قياسها كمياً وتستخدم لحساب كثافة الخلايا، وهنا مثال على الأنسجة المثبتة على شريحة. يتم عرض كل من التجارب الناجحة ودون المستوى للمقارنة. وأخيراً، هناك عدة أنواع مختلفة من القياسات الكمية التي يمكن الحصول عليها من تجربة ناجحة.
وتشمل القياسات الكمية كثافة الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة، ونسبة الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة، والخلايا المتكاثرة الكلية، ومجموع الخلايا الجذعية. على التحفيز contralateral من الخلايا الطحلبية، لوحظ انخفاض في انتشار الخلايا الجذعية العصبية. أهم خطوة في هذا الإجراء هو السيطرة على الأنسجة الغليان في فرن الميكروويف.
سوف تتلف أقسام الأنسجة إذا كانت تغلي لفترة طويلة جدا. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن للمرء أن حقن ناقلات الفيروسية المختلفة لاستهداف الدائرة نفسها. على سبيل المثال، إذا كان أحد تحفيز الدائرة العصبية، يمكن للمرء أن يمنعه باستخدام فيروس DREADD المثبطة.
التقنيات المعروضة في هذا البروتوكول ليست جديدة. ومع ذلك ، فإن قوة هذا البروتوكول هو أنه يغطي بشكل شامل جميع الخطوات اللازمة للإجابة على الأسئلة حول كيفية تأثير الدائرة على النشوء العصبي للبالغين.
