Ce protocole peut répondre à la façon dont divers circuits dans le cerveau régulent la neurogenèse adulte et plus particulièrement comment stimuler ou inhiber les circuits neuronaux affectent la prolifération des cellules souches neurales adultes. L’avantage de cette technique est qu’elle est capable de cibler spécifiquement les circuits neuronaux désirés, ainsi que de réduire la quantité de stress introduite chez les animaux. Cette méthode peut fournir un aperçu de la façon dont différents circuits cérébraux régulent la neurogenèse adulte, en particulier, comment les types de cellules spécifiques qui libèrent certains neurotransmetteurs régulent la prolifération des cellules souches neurales adultes.
Pour commencer cette procédure, placez les sections de tissu dans PBS et montez cinq à huit sections sur une glissière positivement chargée dans l’ordre de série de l’antérieur au postérieur. Laissez sécher les sections tissulaires à température ambiante pendant deux à cinq minutes et adhérez complètement aux toboggans. Ensuite, préparez le tampon de citrate dans un récipient.
Chauffer le tampon de citrate dans un four à micro-ondes pendant cinq minutes jusqu’à ce que la solution soit bouillante. Entre-temps, placez les sections montées dans un porte-glissière en verre. Après cinq minutes, placez soigneusement le porte-glissière avec les sections dans une boîte à pipette.
Réglez la puissance du four à micro-ondes à 50% et le temps de cuisson à sept minutes. Démarrez une minuterie pendant sept minutes et surveillez la solution. Arrêtez le four à micro-ondes lorsque la solution commence à bouillir et continuez le four à micro-ondes après l’arrêt de l’ébullition.
Arrêtez-vous après l’arrêt de la mijoteuse, même si le temps de cuisson au micro-ondes n’est pas terminé. Le but de cette étape est de maintenir l’eau juste en dessous de la température d’ébullition sans laisser l’eau bouillir trop. Trop d’ébullition enlèvera les sections de tissu de la lame.
Ensuite, transférez la boîte chaude avec tampon de citrate et diapositives de tissu à un seau à glace pour le refroidissement. Couvrir la boîte et attendre environ 30 minutes ou jusqu’à ce que la solution soit refroidie au toucher, avant de passer à la coloration analogique thymidine. Pour tacher les sections tissulaires avec de la thymidine analogique, retirez les sections tissulaires du tampon de citrate.
Laissez sécher les sections tissulaires et adhérer complètement aux toboggans, avant de dessiner une bordure avec un stylo hydrophobe. Ensuite, perméabilisez les sections avec tampon de perméabilisation pendant 20 à 30 minutes. Lavez les sections deux fois à l’aide du SCT-triton pendant cinq minutes à chaque fois.
Ensuite, préparez une solution de réaction Edu. Incuber les sections de la solution de réaction Edu pendant 30 minutes à une heure. Par la suite, lavez-les trois fois dans tbs-triton pendant cinq minutes à chaque fois.
Couvrez les glissières dans du papier d’aluminium ou placez-les dans une chambre protégée par la lumière pour vous protéger de la lumière après cette étape. À ce stade, vérifiez si la réaction edu fonctionne à l’aide d’un microscope fluorescent. Les cellules étiquetées Edu doivent être observées si la réaction fonctionne.
Maintenant, bloquer les sections de tissu monté en utilisant tampon de blocage soulevée dans le même animal que l’anticorps secondaire pendant 30 minutes à une heure. Ensuite, lavez-les deux fois dans tbs-triton pendant cinq minutes à chaque fois. Pendant l’étape de blocage, préparez la solution primaire d’anticorps en mélangeant l’anticorps primaire dans le tampon de blocage.
Par la suite, ajouter 250 microlitres de solution d’anticorps primaires par toboggan pour s’assurer que les sections tissulaires sont complètement submergées, et les incuber pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, lavez les sections tissulaires trois fois dans tbs-triton pendant cinq minutes chacun pour enlever l’excès d’anticorps primaire. Ensuite, incuber les sections tissulaires dans des anticorps secondaires conjugués au fluorophore préparés en bloquant la solution tampon pendant deux heures à température ambiante.
Lavez les sections tissulaires trois fois dans tbs-triton pendant cinq minutes chacune pour enlever l’excès d’anticorps secondaire. Ensuite, appliquez la solution DAPI de 300 micromolaires à un à 100 en PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les sections de tissu trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacune pour enlever l’excès de DAPI, et retirez le cercle de stylo PAP autour du tissu à l’aide d’un coton-tige.
Laissez sécher les sections, avant d’appliquer des supports de montage et de les recouvrant de coverslips. À l’aide du logiciel d’imagerie, ouvrez l’image de chaque section de gyrus bosselé comme image composite avec les canaux fusionnés en couleurs distinctes pour visualiser facilement la colocalisation. Ensuite, mesurez la zone de gyrus bosselé dans chaque section à l’aide de l’outil de sélection du polygone, et enregistrez toutes les sections de chaque souris.
Ce sera la zone de gyrus bosselé utilisé pour calculer la densité. À l’aide du compteur de cellules plugin logiciel trouvé sous Plugins, Analyser, Cell Counter, Cell Counter, enregistrer le nombre de cellules dans le gyrus bosselé qui ont colocalisant anticorps primaires et thymidine analogique Edu de l’image composite. En outre, enregistrez le nombre total de cellules edu-positives et nestin-positives avec un processus radial.
Dans le cas de la nichine, il est très important de prêter attention à la morphologie des cellules. Si l’on quantifie les cellules souches neurales, assurez-vous que seules les cellules dont le processus radial est quantifié sont quantifiées. Entrez le nombre de cellules dans un logiciel de feuille de calcul pour compiler toutes les données pour analyse ultérieurement.
Par exemple, pour obtenir la densité des cellules souches, divisez la somme des cellules nestin-positives et edu-positives par la somme du volume de gyrus dentate chez chaque animal. Calculez le volume de chaque section en multipliant la zone avec des incréments totaux en z-step, en supposant que chaque étape est d’un micromètre. Dans ce protocole, les étapes totales devraient être proches de 40 puisque le tissu est sectionné à 40 micromètres.
Calculez par la suite le nombre global de cellules proliférantes, le pourcentage de cellules souches neurales proliférantes et les cellules proliférantes totales après avoir stimulé les cellules moussues contralatérales. En utilisant un Edu analogique de thymidine et une récupération d’antigène pour la coloration de nidin, les cellules souches neurales proliférantes ont été avec succès étiquetées. En outre, en omettant l’étape de récupération d’antigène, l’ancêtre neural Tbr2-positif et le neuroblaste et le neuroblaste DCX-positif et les neurones immatures ont été étiquetés.
Voici un exemple de la zone quantifiée et utilisée pour calculer la densité cellulaire, et voici un exemple du tissu monté sur une diapositive. Les expériences réussies et inférieures à la normale sont présentées à des fins de comparaison. Enfin, il existe plusieurs quantifications différentes qui peuvent être obtenues à partir d’une expérience réussie.
Les quantifications incluent la densité des cellules souches neurales proliférantes, le pourcentage de cellules souches neurales proliférantes, les cellules proliférantes totales, et le pool total de cellules souches. Lors de la stimulation contralatérale des cellules moussées, une diminution de la prolifération des cellules souches neurales a été observée. L’étape la plus importante dans cette procédure est de contrôler l’ébullition des tissus dans le four à micro-ondes.
Les sections tissulaires seront endommagées si elles bouillent trop longtemps. Après avoir suivi cette procédure, on pourrait injecter différents vecteurs viraux pour cibler le même circuit. Par exemple, si l’on stimulant un circuit neuronal, on pourrait l’inhiber à l’aide d’un virus inhibitrice DREADD.
Les techniques présentées dans ce protocole ne sont pas nouvelles. Cependant, la force de ce protocole est qu’il couvre de manière exhaustive toutes les étapes nécessaires pour répondre aux questions sur l’impact du circuit sur la neurogenèse chez les adultes.
