Questo protocollo può rispondere a come vari circuiti nel cervello regolano la neurogenesi adulta e in particolare come i circuiti neurali stimolanti o inibitori influenzano la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte. Il vantaggio di questa tecnica è che è in grado di indirizzare specificamente i circuiti neurali desiderati, oltre a ridurre la quantità di stress introdotta agli animali. Questo metodo può fornire informazioni su come i diversi circuiti cerebrali regolano la neurogenesi adulta, in particolare su come specifici tipi di cellule che rilasciano determinati neurotrasmettitori regolano la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte.
Per iniziare questa procedura, posizionare le sezioni tissutali in PBS e montare da cinque a otto sezioni su uno scivolo caricato positivamente in ordine seriale da anteriore a posteriore. Lasciare asciugare le sezioni tissutali a temperatura ambiente per due o cinque minuti e aderire completamente alle diapositive. Quindi, preparare il buffer di citrato in un contenitore.
Riscaldare il tampone di citrato in un forno a microonde per cinque minuti fino a quando la soluzione non bolle. Nel frattempo, posizionare le sezioni montate in un porta scorrevole in vetro. Dopo cinque minuti, posizionare con cura il porta scorrevole con le sezioni in una scatola di pipetta.
Impostare la potenza del forno a microonde sul 50% e il tempo di cottura su sette minuti. Avviare un timer per sette minuti e monitorare la soluzione. Arrestare il forno a microonde quando la soluzione inizia a bollire e continuare il microonde dopo che l'ebollizione si interrompe.
Fermati dopo che il timer si è esaurito, anche se il tempo di cottura sul microonde non è finito. L'obiettivo di questo passaggio è quello di mantenere l'acqua appena sotto la temperatura di ebollizione senza lasciare bollire ebollizione esvolva l'acqua. Un'ebollizione troppo rimuoverà le sezioni di tessuto dalla diapositiva.
Quindi, trasferire la scatola calda con tampone di citrato e scivoli di tessuto in un secchio di ghiaccio per il raffreddamento. Coprire la scatola e attendere circa 30 minuti o fino a quando la soluzione non è fresca al tatto, prima di procedere alla colorazione analogica della timmidina. Per macchiare le sezioni tissutali con l'analogico timidina, rimuovere le sezioni tissutali dal tampone del citrato.
Lasciare asciugare le sezioni tissutali e aderire completamente alle diapositive, prima di disegnare un bordo con una penna idrofobica. Successivamente, permeabilizzare le sezioni con tampone di permeabilizzazione per 20-30 minuti. Lavare le sezioni due volte utilizzando TBS-tritone per cinque minuti ogni volta.
Quindi, preparare una soluzione di reazione Edu. Incubare le sezioni in soluzione di reazione Edu per 30 minuti a un'ora. Successivamente, lavarli tre volte in TBS-tritone per cinque minuti ogni volta.
Coprire gli scivoli in un foglio di alluminio o posizionarli in una camera protetta dalla luce per proteggersi dalla luce dopo questo passaggio. In questa fase, verificare se la reazione Edu funziona utilizzando un microscopio fluorescente. Le cellule etichettate Edu devono essere osservate se la reazione funziona.
Ora, blocca le sezioni di tessuto montate usando il tampone di blocco sollevato nello stesso animale dell'anticorpo secondario per 30 minuti a un'ora. Quindi, lavarli due volte in TBS-tritone per cinque minuti ogni volta. Durante la fase di blocco, preparare la soluzione di anticorpi primari mescolando l'anticorpo primario nel tampone di blocco.
Successivamente, aggiungere 250 microlitri di soluzione anticorpale primaria per diapositiva per garantire che le sezioni tissutali siano completamente sommerse e incubarle durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, lavare le sezioni tissutali tre volte in TBS-tritone per cinque minuti ciascuna per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso. Quindi, incubare le sezioni tissutali in anticorpi secondari coniugati al fluoroforo preparati in soluzione tampone bloccante per due ore a temperatura ambiente.
Lavare le sezioni tissutali tre volte in TBS-tritone per cinque minuti ciascuna per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso. Successivamente, applicare la soluzione DAPI da 300 micromolare a uno o 100 in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le sezioni di tessuto tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna per rimuovere il DAPI in eccesso e rimuovere il cerchio della penna PAP intorno al tessuto utilizzando un batuffolo di cotone.
Lasciare asciugare le sezioni, prima di applicare i supporti di montaggio e coprirli con coverlips. Utilizzando il software di imaging, apri l'immagine di ogni sezione di giro dentato come immagine composita con i canali uniti in colori distinti per visualizzare facilmente la colocalizzazione. Quindi, misurare l'area del giro dentato in ogni sezione utilizzando lo strumento di selezione poligonale e registrare tutte le sezioni di ogni mouse.
Questa sarà l'area del giro dentato utilizzata per calcolare la densità. Utilizzando il contatore di celle plugin software trovato in Plugins, Analyze, Cell Counter, Cell Counter, registrare il numero di cellule nel giro dentato che hanno colocalizzante anticorpo primario e edu analogico di timmidina dall'immagine composita. Inoltre, registrare il numero totale di cellule Edu-positive e nestin-positive con un processo radiale.
Nel caso della nedcina, è molto importante prestare attenzione alla morfologia delle cellule. Se si quantificano le cellule staminali neurali, assicurarsi che vengano quantificate solo le cellule con un processo radiale. Immettere il conteggio delle celle in un software per fogli di calcolo per compilare tutti i dati per l'analisi in un secondo momento.
Ad esempio, per ottenere la densità delle cellule staminali, dividere la somma delle cellule positive alla nenina e edu-positive per la somma del volume di giro dentato in ogni animale. Calcola il volume di ogni sezione moltiplicando l'area con incrementi totali del passo Z, supponendo che ogni passo sia un micrometro. In questo protocollo, i passaggi totali dovrebbero essere vicini a 40 poiché il tessuto viene sesato a 40 micrometri.
Successivamente, calcola il numero complessivo di cellule prolifere, la percentuale di cellule staminali neurali prolifere e le cellule prolifere totali dopo aver stimolato le cellule muschiate contralaterali. Utilizzando un Edu analogico di timidina e un recupero dell'antigene per la colorazione della nedcina, le cellule staminali neurali proliferati sono state etichettate con successo. Inoltre, omettendo il passo di recupero dell'antigene, sono stati etichettati il progenitore neurale e neuroblasto tbr2-positivo e i neuroblasti e immaturi positivi alla DCX.
Ecco un esempio dell'area quantificata e utilizzata per calcolare la densità cellulare, ed ecco un esempio del tessuto montato su una diapositiva. Sia gli esperimenti riusciti che gli esperimenti sub-par sono mostrati per il confronto. Infine, ci sono diverse quantificazioni che possono essere ottenute da un esperimento riuscito.
Le quantificazioni includono la densità delle cellule staminali neurali prolifere, la percentuale di cellule staminali neurali prolifere, le cellule prolifere totali e il pool totale di cellule staminali. Dopo la stimolazione contralaterale delle cellule muschiate, è stata osservata una diminuzione della proliferazione delle cellule staminali neurali. Il passo più importante in questa procedura è controllare l'ebollizione dei tessuti nel forno a microonde.
Le sezioni tissutali saranno danneggiate se bolleno troppo a lungo. Dopo aver seguito questa procedura, si potrebbero iniettare diversi vettori virali per colpire lo stesso circuito. Ad esempio, se si stimola un circuito neurale, si potrebbe inibirlo usando un virus DREADD inibitorio.
Le tecniche presentate in questo protocollo non sono nuove. Tuttavia, il punto di forza di questo protocollo è che copre in modo completo tutti i passaggi necessari per rispondere alle domande su come il circuito influisce sulla neurogenesi adulta.
