このプロトコルは、脳内の様々な回路が成人の神経新生を調節する方法、および具体的に神経回路の刺激または阻害が成人神経幹細胞の増殖にどのような影響を与えるかに答えることができる。この技術の利点は、所望の神経回路を特異的に標的化できるとともに、動物に導入されるストレスの量を減らすことが可能である。この方法は、異なる脳回路が成人の神経新生を調節する方法についての洞察を提供することができます, 特に, 特定の神経伝達物質を放出する特定の細胞タイプは、成人の神経幹細胞増殖を調節する方法.
この手順を開始するには、PBSに組織切片を配置し、前から後部までの順に正に帯電したスライドに5〜8個のセクションを取り付けます。組織切片を室温で2〜5分間乾燥させ、スライドに完全に付着させます。次に、容器内にクエン酸バッファーを用意します。
電子レンジでクエン酸バッファーを5分間加熱し、溶液が沸騰します。その間、取り付けられたセクションをガラススライドホルダに入れます。5分後、スライドホルダーをセクションに入れて慎重にピペットボックスに入れます。
電子レンジの電源を50%、調理時間を7分に設定します。タイマーを 7 分間開始し、ソリューションを監視します。溶液が沸騰し始めたら電子レンジを止め、沸騰後に電子レンジを続けます。
電子レンジの調理時間が終了していなくても、タイマーが切れた後に停止します。このステップの目標は、水を過度に沸騰させることなく、沸騰温度以下に保つことです。沸騰しすぎると、スライドから組織切片が取り除かれます。
次に、クエン酸バッファーと組織スライドを備えたウォームボックスを冷却用のアイスバケツに移します。箱を覆い、約30分間待つか、溶液が接触するまで待ってから、チミジンアナログ染色に進みます。チミジンアナログで組織切片を染色するには、クエン酸緩衝液から組織切片を取り除く。
疎水性ペンで境界を描く前に、組織の切片を乾燥させてスライドに完全に付着させます。次に、パーメアビライズバッファーで20〜30分間パーメビリゼーションを行います。TBSトリトンを使用してセクションを2回洗浄し、毎回5分間洗浄します。
次いで、エドゥ反応液を調製する。エドゥ反応液中の切片を30分~1時間インキュベートする。その後、TBS-トリトンで3回、毎回5分間洗います。
スライドをアルミホイルで覆うか、光保護チャンバーに入れて、このステップの後に光から保護します。この段階では、蛍光顕微鏡を用いて、Edu反応が機能するかどうかを確認します。反応が働く場合、エドゥ標識細胞を観察する必要があります。
さて、二次抗体と同じ動物で発生したブロッキングバッファーを使用して、取り付けられた組織切片を30分〜1時間ブロックする。その後、TBSトリトンで2回、毎回5分間洗います。ブロッキングステップ中に、一次抗体をブロッキングバッファーに混合して一次抗体溶液を調製する。
続いて、スライド当たり250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えて、組織切片が完全に水没していることを確認し、室温で一晩インキュベートします。翌日、組織切片をTBS-トリトンでそれぞれ5分間3回洗浄し、過剰な一次抗体を除去する。次いで、フルオロフォア共役二次抗体で組織切片を室温で2時間ブロッキング緩衝液に調製してインキュベートする。
組織切片をTBS-トリトンでそれぞれ5分間3回洗浄し、過剰な二次抗体を除去します。次に、PBSで1~100で300マイクロモルDAPI溶液を室温で15分間塗布する。その後、組織切片をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄して余分なDAPIを除去し、綿棒を使用して組織の周りのPAPペンサークルを取り除きます。
取り付けメディアを塗布し、カバーリップでそれらをカバーする前に、セクションを乾燥させてください。イメージングソフトウェアを使用して、各デンテート回セクションの画像を合成画像として開き、チャネルを異なる色で結合して、共局在化を容易に視覚化します。次に、ポリゴン選択ツールを用いて各区間のデンテート回の面積を測定し、各マウスの全ての部分を記録する。
これは密度を計算するために使用されるデンテート回の面積になります。プラグイン、分析、セルカウンター、セルカウンターの下にあるソフトウェアプラグインセルカウンターを使用して、複合画像から一次抗体とチミジンアナログEduを共局化しているデンテート回の細胞数を記録します。さらに、放射状プロセスで、Edu 陽性細胞とネスチン陽性セルの総数を記録します。
ネスチンの場合、細胞の形態に注意を払うことが非常に重要です。神経幹細胞を定量化する場合は、放射状プロセスを持つ細胞のみが定量化されるようにしてください。スプレッドシート ソフトウェアにセル数を入力し、後で分析するためにすべてのデータをコンパイルします。
例えば、幹細胞密度を求めるには、各動物のデンテート回の体積の合計で、ネスチン陽性細胞とEdu陽性細胞の合計を割る。各ステップが1マイクロメートルであると仮定して、合計Zステップ増分で面積を乗算することによって、各セクションの体積を計算します。このプロトコルでは、組織が40マイクロメートルで切除されるため、総ステップは40に近いはずです。
続いて、増殖細胞の総数、増殖性神経幹細胞の割合、および対側苔むした細胞を刺激した後の全増殖細胞を計算する。ブチインアナログエドゥと抗原検索を用いて、増殖性神経幹細胞を正常に標識した。さらに、抗原検索ステップを省略することにより、Tbr2陽性神経前駆物質および神経芽細胞およびDCX陽性神経芽細胞および未熟ニューロンを標識した。
以下は、細胞密度の算出に用いる面積の例であり、スライド上に取り付けられた組織の例を以下に示す。成功した実験とサブパー実験の両方が比較のために示されています。最後に、実験を成功させたものから得られるいくつかの異なる定量があります。
定量には、増殖する神経幹細胞の密度、増殖する神経幹細胞の割合、全増殖細胞、および総幹細胞プールが含まれる。苔むした細胞の対側刺激では、神経幹細胞増殖の減少が観察された。この手順の最も重要なステップは、電子レンジでの組織の沸騰を制御することです。
彼らはあまりにも長い間沸騰している場合、組織の切片が損傷します.この手順に従った後、同じ回路を標的とする異なるウイルスベクターを注入することができる。例えば、神経回路を刺激している場合、阻害性DREADDウイルスを使用してそれを阻害することができます。
このプロトコルで提示された技術は斬新ではありません。しかし、このプロトコルの強みは、回路が成人の神経新生に与える影響に関する質問に答えるために必要なすべてのステップを包括的にカバーしていることです。
