يسمح هذا البروتوكول في دراسة في الجسم الحي للتفاعلات المبكرة بين الخلايا السرطانية والأعصاب ودراسة المسارات الجزيئية لغزو العصب في السرطان. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي الوقت التجريبي القصير مع إمكانية دراسة الغزو الاعمني والأنماط الظاهرية الأخرى للسرطان في نفس التجربة. قبل تجربة هذه التقنية للمرة الأولى، نوصي بممارسة حفر البيض غير المخصب التجاري وحصاد العقدة الجذرية الظهرية لتحسين الأسلوب الخاص بك لكلا الإجراءين.
إثبات الإجراء سيكون مين ليو، باحث مشارك من مختبري. تبدأ باحتضان ستة بويضات مخصبة خالية من مسببات الأمراض التجارية لكل مجموعة تجريبية في حاضنة ترطيب البيض عند 38 درجة مئوية ورطوبة 54٪ في اليوم الأول بعد الإخصاب لمدة ثمانية أيام مع دوران كل ساعة. في اليوم الثامن، نظف الجلد الظهري من فأر القتل الرحيم مع 70٪ الإيثانول واستخدم المقص لإزالة العمود الفقري.
فصل مناطق عنق الرحم والصدر والقطعي ووضع أقسام العمود الفقري في طبق ثقافة 10 سنتيمترات مع برنامج تلفزيوني للحفاظ على عينات الأنسجة رطب. باستخدام مقص العظام الحساسة، فتح العظام الصدرية والعنق العنقي في الجوانب الظهرية والبنتينتال لفصل العمود الفقري إلى نصفين جانبي ووضع أقسام الأنسجة في طبق نظيف 10 سم مع برنامج تلفزيوني جديد. باستخدام ملقط، فصل بلطف الحبل الشوكي من العظام الفقارية لتصور العصابات جذر الظهرية.
وضع نصائح لزوج من ملقط غرامة عقد تحت كل ganglion، فهم الأنسجة وسحبه من تجويف العظام التي استقرت فيه. مباشرة بعد الحصاد، ضع كل ganglion في المتوسط ثقافة DMEM تكمل مع 2٪ من البنسلين وstreptomycin أو القلم-سترب و 10٪ مصل الأبقار الجنينية أو FBS للمساعدة في منع التلوث البكتيري للأنسجة العصبية. عندما تم حصاد كل من ganglia، نقل الأنسجة إلى طبق ثقافة جديدة تحتوي على ثقافة DMEM الطازجة المتوسطة تستكمل مع 2٪ القلم-ستريب بالإضافة إلى 10٪ FBS و 1.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من صبغة الفلورسنت الحمراء لاحتضان لمدة ساعة واحدة في حاضنة ثقافة الخلية.
لإعداد البيض لالرقعة العقدية الجذر الظهرية، تعتيم الضوء في مجلس الوزراء تدفق لارينار وعقد البيض مع كيس الهواء التي تحدث بشكل طبيعي نحو مصدر الضوء، transilluminate كل بيضة للتحقق من صلاحية الفرخ ومرحلة الجنين. تحديد ارتباط الجنين النامي بالغشاء الكورمي كحلقة دموية مُتعلقة بغشاء البيض واستخدم قلم رصاص لوضع علامة على المرفق لتجنب التدخلات في هذه المنطقة. رسم منطقة 1.5 سنتيمتر في منطقة الأوعية الدموية جيدا على الأقل سنتيمترين من مرفق الجنين لتكون بمثابة منطقة نافذة التشغيل ورسم 0.5 سنتيمتر مربع في منطقة أقل الأوعية الدموية ما يقرب من سنتيمتر واحد من نافذة التشغيل.
ثم وضع علامة على مركز منطقة الكيس الجوي. بعد ذلك ، استخدم أداة دوارة وحفر النقش مع بت قطره ثلاثة ملليمتر لحفر قشر البيض بعناية داخل المربع المميز. استخدام ملقط حادة لإزالة قشر البيض دون إزالة غشاء قشر البيض الأبيض الخارجي الحق تحت قذيفة.
استخدام الحفر لجعل بعناية ثقب الحفر محددة في الصليب ملحوظ في منطقة الكيس الهواء للسماح تدفق الهواء في البيض دون كسر أو إتلاف قذيفة وإضافة 30 ميكرولترات من HBSS لفتح مربع على غشاء قشر البيض الخارجي سليمة. باستخدام إبرة قياس 30، وجعل ثقب تحديد في الغشاء الخارجي داخل منطقة مربعة. بعد ذلك، عقد البيض حتى مصدر الضوء لتصور كيس الهواء وتطبيق الضغط على لمبة مطاطية الشافطة.
ضع مصباح العين فوق الثقوبة الصغيرة داخل كيس الهواء وحرر الضغط على المصباح حتى يتم ملاحظة فصل الغشاء الخارجي والأغشية المشيمية ضمن منطقة نافذة التشغيل وتكرار هذه الخطوة حتى يتحقق فصل تام للأغشية. عندما تم تعديل جميع البيض بنفس الطريقة ، قم بحفر نافذة التشغيل الدائرية في بيضة واحدة مع الحرص على عدم تمزيق غشاء قشر البيض الخارجي واستخدام الجانب اللزجة من قطعة من الشريط اللاصق لإزالة أي جزيئات فضفاضة من القشرة. باستخدام ملقط حادة، وإزالة قشر البيض من المنطقة حفر تليها غشاء قشر البيض الخارجي مع الحرص على عدم إدخال جزيئات قذيفة صغيرة داخل البيض للحد من التلوث.
عندما تمت إزالة قشرة البيض والغشاء الخارجي كما هو موضح، تغطية البيض مع غشاء شمع البارافين ووضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض دون تناوب حتى ganglia جذر الظهر جاهزة لتطعيم. من أجل تطعيم العقدة جذر الظهرية على الغشاء الكورمي، واستخدام الملذات معقمة غرامة لفهم بعناية واحدة العقدة في طبق الثقافة وغسل بلطف الأنسجة في وعاء من HBSS الطازجة. ضع العقدة على الغشاء الكورالي من بيضة واحدة مع الحرص على عدم ثقب الغشاء وتغطية جميع فتحات البيض مع الضمادات الشفافة العقيمة.
عندما يتم تطعيم جميع البيض ، أعيده إلى حاضنة البيض المرطب لمدة يومين دون دوران. في نهاية الحضانة، نقل البيض إلى مجلس الوزراء تدفق لارينار واستخدام مقص والملقط لفتح خلع الملابس الفيلم شفافة. بعد ذلك، إضافة 0.5 إلى مليون الخلايا السرطانية المسمى الفلورسنت في خمسة microliters من HBSS على الغشاء الكورمي لكل بيضة حوالي مليمترين من كل ganglion الجذر الظهري الحفاظ على مسافة موحدة بين ganglia والخلايا.
ثم غطي البيض بصلصة فيلم جديدة واعيدي البيض إلى حاضنة البيض لمدة سبعة أيام دون دوران. في نهاية الحضانة، ضع البيض على أعلى مقاعد البدلاء المختبر. استخدام حقنة لثقب فيلم خلع الملابس من كل بيضة وتطبيق حوالي 300 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde على كل غشاء كورالاطوية لتشدبل قليلا الأنسجة لتسهيل عملية الحصاد.
باستخدام مقص، وإزالة النصف العلوي من قشر البيض مع الغشاء كورالاتاطوية المرفقة. تقليل حجم قذيفة إلى ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات في القطر حفظ جزء من الغشاء الكورمي حيث تم تطعيم العقدة الجذر الظهري والخلايا السرطانية داخل مركز جزء قذيفة. ثم فهم الغشاء الكورمي مع ملقط غرامة وفصل الأنسجة من قشر البيض لنقلها إلى بئر واحد من لوحة ستة جيدا تحتوي على اثنين من ملليلتر من 4٪ شبهformaldehyde في العقدة جذر الظهرية جيدا وجنب الخلية الورم.
إن دمج جذر الظهر العقدية في الغشاء الكورمي من المهم أن يوفر الغشاء الكورمي لوطيونة التغذية إلى أنسجة العقدة الجذرية الظهرية أثناء التجربة. مجهريا، لوحظ العقدة جذر الظهرية داخل النسيج الضام للغشاء الكورمي والأوعية الدموية وغالبا ما ينظر داخل أنسجة العقدة جذر الظهر مما يشير إلى أن إمدادات الدم غشاء كورالاتويك تغذية الأنسجة المطعمة. يتم تحديد الأورام المزروعة أيضا على الغشاء الكورالي من قبل الهماوكسيلين وتلطيخ ايوسين.
اعتمادا على مدى الغزو موجود، قد الأورام الحاضر مع لا لجزر الورم العديد من غزو النسيج الضام. في هذه التجربة التمثيلية، التصوير مع تحليل الفلورسين دمج كشفت عن غزو متزايد من العقدة جذر الظهرية في الأغشية المشيمية المطعمة مع الخلايا السرطانية على التعبير عن مستقبلات جالانين 2 مقارنة مع السيطرة على الأورام. ويمكن تكرار هذا مفيد وفعال من حيث التكلفة في نموذج vivo للغزو في حدودية حتى من قبل المختبرات ذات الموارد المحدودة.
