Ce protocole permet l’étude in vivo des interactions précoces entre les cellules tumorales et les nerfs et l’étude des voies moléculaires de l’invasion nerveuse dans le cancer. Les principaux avantages de cette technique sont le court temps expérimental avec le potentiel d’étudier l’invasion périnienne et d’autres phénotypes de cancer dans la même expérience. Avant d’essayer cette technique pour la première fois, nous vous recommandons de pratiquer le forage commercial d’œufs non fertilisés et de récolter les ganglions de racines dorsales afin d’optimiser votre technique pour les deux procédures.
La démonstration de la procédure sera Min Liu, un associé de recherche de mon laboratoire. Commencez par couver six œufs fertilisés commerciaux exempts d’agents pathogènes par groupe expérimental dans un incubateur d’humidificateur d’œufs à 38 degrés Celsius et 54 % d’humidité le premier jour après la fécondation pendant huit jours avec rotation horaire. Le huitième jour, nettoyez la peau dorsale d’un rat euthanasié avec 70% d’éthanol et utilisez des ciseaux pour enlever la colonne vertébrale.
Séparez les régions cervicales, thoraciques et lombaires et placez les sections de la colonne vertébrale dans un plat de culture de 10 centimètres avec PBS pour garder les échantillons de tissus hydratés. À l’aide de ciseaux osseux délicats, ouvrez les os vertébraux thoraciques et cervicals dans les aspects dorsales et ventrales pour séparer la colonne vertébrale en deux moitiés latérales et placer les sections tissulaires dans un plat propre de 10 centimètres avec du PBS frais. À l’aide de forceps, détachez doucement la moelle épinière des os vertébraux pour visualiser les ganglions de racines dorsales.
Placer les extrémités d’une paire de forceps fins maintenus sous chaque ganglion, saisir le tissu et le tirer de la cavité osseuse dans laquelle il est logé. Immédiatement après la récolte, placez chaque ganglion dans le milieu de culture DMEM complété par 2% de pénicilline et de streptomycine ou Pen-Strep et 10% sérum bovin fœtal ou FBS pour aider à prévenir la contamination bactérienne des tissus nerveux. Lorsque toutes les ganglions ont été récoltées, transférer les tissus dans un nouveau plat de culture contenant du milieu de culture DMEM frais complété par 2% Pen-Strep plus 10%FBS et 1,2 microgrammes par millilitre de colorant fluorescent rouge pour une incubation d’une heure dans l’incubateur de culture cellulaire.
Pour préparer les oeufs pour la greffe dorsale de ganglion de racine, obscurcir la lumière dans une armoire d’écoulement laminaire et tenir l’oeuf avec le sac d’air naturel vers la source lumineuse, transilluminer chaque oeuf pour vérifier la viabilité du poussin et la phase embryonnaire. Identifier l’attachement de l’embryon en développement à la membrane chorioallantoïque comme un récipient en mouvement foncé attaché à la membrane de l’œuf et utiliser un crayon pour marquer l’attachement pour éviter les interventions dans cette région. Dessinez une région de 1,5 centimètre dans une zone bien vascularisée à au moins deux centimètres de l’attachement de l’embryon pour agir comme une zone de fenêtre d’opération et dessiner un carré de 0,5 centimètre dans une zone moins vascularisée à environ un centimètre de la fenêtre d’opération.
Ensuite, marquez le centre de la région air sac. Ensuite, utilisez un outil rotatif et une perceuse de gravure avec un morceau de trois millimètres de diamètre pour percer soigneusement la coquille d’œuf dans le carré marqué. Utilisez des forceps contondants pour enlever la coquille d’œuf sans enlever la membrane extérieure blanche de coquille d’œuf juste sous la coquille.
Utilisez la perceuse pour effectuer soigneusement une perforation précise dans la croix marquée dans la zone du sac gonflable pour permettre le flux d’air dans l’œuf sans casser ou endommager la coquille et ajouter 30 microlitres de HBSS à l’ouverture carrée au-dessus de la membrane extérieure intacte de la coquille d’œuf. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, faire une perforation précise dans la membrane externe dans la zone carrée. Ensuite, maintenez l’œuf jusqu’à la source de lumière pour visualiser le sac d’air et appliquer une pression sur une ampoule en caoutchouc eyedropper.
Placez l’ampoule eyedropper sur la petite perforation dans le sac d’air et relâchez la pression sur l’ampoule jusqu’à ce qu’une séparation de la membrane externe et des membranes chorioallantoïques dans la zone de fenêtre de fonctionnement soit observée répétant cette étape jusqu’à ce qu’une séparation complète des membranes soit réalisée. Lorsque tous les oeufs ont été modifiés de la même manière, percer la fenêtre de fonctionnement circulaire dans un œuf en prenant soin de ne pas rompre la membrane extérieure coquille d’œuf et utiliser le côté collant d’un morceau de ruban adhésif pour enlever les particules lâches de la coquille. À l’aide de forceps contondants, retirer la coquille d’œuf de la zone forée suivie de la membrane externe de la coquille d’œuf en prenant soin de ne pas introduire de petites particules de coquille à l’intérieur de l’œuf afin de minimiser la contamination.
Lorsque la coquille d’œuf et la membrane externe ont été enlevées comme démontré, couvrir les œufs d’une membrane de cire de paraffine et remettre les œufs dans l’incubateur d’œufs sans rotation jusqu’à ce que les ganglions de racines dorsales soient prêts à être greffés. Pour greffer un ganglion de racine dorsale sur la membrane chorioallantoic, utilisez les forceps stériles fins pour saisir soigneusement un ganglion dans le plat de culture et lavez doucement le tissu dans un récipient de HBSS frais. Placer le ganglion sur la membrane chorioallantoïque d’un œuf en prenant soin de ne pas percer la membrane et couvrir toutes les ouvertures d’œufs avec des pansements de film transparents stériles.
Lorsque tous les œufs ont été greffés, retournez-les à l’incubateur d’œufs humidificateurs pendant deux jours sans rotation. À la fin de l’incubation, transférer les œufs dans l’armoire à écoulement laminaire et utiliser des ciseaux et des forceps pour ouvrir la vinaigrette transparente. Ensuite, ajoutez 0,5 à un million de cellules tumorales étiquetées fluorescentes dans cinq microlitres de HBSS sur la membrane chorioallantoïque de chaque œuf à environ deux millimètres de chaque ganglion de racine dorsale gardant une distance uniforme entre les ganglions et les cellules.
Couvrez ensuite les œufs d’une nouvelle vinaigrette au film et retournez les œufs à l’incubateur d’œufs pendant sept jours sans rotation. À la fin de l’incubation, déposer les œufs sur le dessus du banc de laboratoire. Utilisez une seringue pour perforer l’habillage de chaque œuf et appliquer environ 300 microlitres de 4% de paraformaldéhyde sur chaque membrane chorioallantoic pour raidir légèrement le tissu pour faciliter le processus de récolte.
À l’aide de ciseaux, retirer la moitié supérieure de la coquille d’œuf avec la membrane chorioallantoïque attachée. Réduire la taille de la coquille à environ trois centimètres de diamètre en gardant la partie de la membrane chorioallantoïque où ganglion de racines dorsales et cellules tumorales ont été greffés au centre du fragment de coquille. Puis saisir la membrane chorioallantoic avec des forceps fins et détacher le tissu de la coquille d’oeuf pour le transfert dans un puits d’une plaque de six puits contenant deux millilitres de 4%paraformaldéhyde par ganglion de racine dorsale bien et côté cellule tumorale vers le haut.
L’intégration des ganglions de racine dorsale dans la membrane chorioallantoic est importante car la membrane chorioallantoic fournit la nutrition au tissu dorsale de ganglion de racine pendant l’expérience. Microscopiquement, le ganglion dorsale de racine est observé dans le tissu conjonctif de la membrane chorioallantoic et les vaisseaux sanguins sont souvent vus à l’intérieur du tissu dorsale de ganglion de racine suggérant que l’approvisionnement en sang de membrane chorioallantoic nourrissant le tissu greffé. Des tumeurs implantées sont également identifiées sur la membrane chorioallantoic par la coloration d’hématoxyline et d’éosine.
Selon la quantité d’invasion est présente, les tumeurs pourraient se présenter sans à de nombreuses îles tumorales envahissant le tissu conjonctif. Dans cette expérience représentative, la formation image avec l’analyse de fluorescence de fusion a indiqué une invasion accrue du ganglion dorsale de racine dans les membranes chorioallantoic greffées avec des cellules de tumeur au-dessus d’exprimer le récepteur de galanin 2 comparé aux tumeurs de contrôle. Ce modèle in vivo utile et rentable d’invasion périnienne peut être reproduit même par des laboratoires aux ressources limitées.
