Este protocolo permite el estudio in vivo de interacciones tempranas entre las células tumorales y los nervios y el estudio de las vías moleculares de la invasión nerviosa en el cáncer. Las principales ventajas de esta técnica son el corto tiempo experimental con el potencial de estudiar la invasión perineural y otros fenotipos de cáncer en el mismo experimento. Antes de probar esta técnica por primera vez, recomendamos practicar la perforación comercial de huevos no fertilizados comerciales y la cosecha de los ganglios de raíz dorsal para optimizar su técnica para ambos procedimientos.
Demostrar el procedimiento estará Min Liu, un investigador asociado de mi laboratorio. Comience incubando seis óvulos fertilizados comerciales libres de patógenos por grupo experimental en una incubadora humidificadora de óvulos a 38 grados centígrados y un 54% de humedad el primer día después de la fertilización durante ocho días con rotación por hora. En el octavo día, limpie la piel dorsal de una rata eutanasia con 70% de etanol y use tijeras para eliminar la columna vertebral.
Separe las regiones cervical, torácica y lumbar y coloque las secciones de la columna vertebral en un plato de cultivo de 10 centímetros con PBS para mantener las muestras de tejido hidratadas. Usando delicadas tijeras óseas, abra los huesos vertebrales torácicos y cervicales en los aspectos dorsal y ventral para separar la columna vertebral en dos mitades laterales y colocar las secciones del tejido en un plato limpio de 10 centímetros con PBS fresco. Usando fórceps, separe suavemente la médula espinal de los huesos vertebrales para visualizar los ganglios de la raíz dorsal.
Colocación de las puntas de un par de fórceps finos sostenidos debajo de cada ganglio, agarrar el tejido y tirar de él de la cavidad ósea en la que se aloja. Inmediatamente después de la cosecha, coloque cada ganglio en el medio de cultivo DMEM complementado con 2%penicilina y estreptomicina o Pluma-Strep y 10%suero bovino fetal o FBS para ayudar a prevenir la contaminación bacteriana de los tejidos nerviosos. Cuando todos los ganglios hayan sido cosechados, transfiera los tejidos a un nuevo plato de cultivo que contenga un medio de cultivo DMEM fresco complementado con 2%Pen-Strep más 10%FBS y 1.2 microgramos por mililitro de tinte fluorescente rojo para una incubación de una hora en la incubadora de cultivo celular.
Para preparar los huevos para el injerto ganglionar de raíz dorsal, atenúe la luz en un armario de flujo laminar y sostenga el huevo con el saco de aire natural hacia la fuente de luz, transiluminar cada óvulo para comprobar la viabilidad del polluelo y la fase embrionaria. Identificar la fijación del embrión en desarrollo a la membrana corioalantoica como un recipiente móvil oscuro unido a la membrana del huevo y utilizar un lápiz para marcar el accesorio para evitar intervenciones en esta región. Dibuje una región de 1,5 centímetros en un área bien vascularizada al menos dos centímetros del accesorio embrionario para actuar como un área de ventana operativa y dibujar un cuadrado de 0,5 centímetros en un área menos vascularizada aproximadamente a un centímetro de la ventana operativa.
A continuación, marque el centro de la región del saco de aire. A continuación, utilice una herramienta giratoria y un taladro de grabado con una broca de tres milímetros de diámetro para perforar cuidadosamente la cáscara de huevo dentro del cuadrado marcado. Utilice fórceps contundentes para eliminar la cáscara de huevo sin quitar la membrana exterior blanca de cáscara de huevo justo debajo de la cáscara.
Utilice el taladro para realizar cuidadosamente una perforación de perforación precisa en la cruz marcada en el área del saco de aire para permitir el flujo de aire en el huevo sin romper o dañar la cáscara y añadir 30 microlitros de HBSS a la abertura cuadrada sobre la membrana de cáscara de huevo exterior intacta. Usando una aguja de calibre 30, haga una perforación precisa en la membrana externa dentro del área cuadrada. A continuación, sostenga el huevo hasta la fuente de luz para visualizar el saco de aire y aplique presión a una bombilla de goma cuentagotas.
Coloque el bulbo cuentagotas sobre la pequeña perforación dentro del saco de aire y suelte la presión sobre la bombilla hasta que se observe una separación de la membrana externa y las membranas corioalantoicas dentro del área de la ventana de operación repitiendo este paso hasta que se logre una separación completa de las membranas. Cuando todos los huevos hayan sido modificados de la misma manera, perfore la ventana de operación circular en un huevo teniendo cuidado de no romper la membrana exterior de la cáscara de huevo y utilizar el lado pegajoso de un pedazo de cinta adhesiva para eliminar las partículas sueltas de la cáscara. Usando fórceps contundentes, retire la cáscara de huevo del área perforada seguida de la membrana externa de cáscara de huevo teniendo cuidado de no introducir pequeñas partículas de cáscara dentro del huevo para minimizar la contaminación.
Cuando la cáscara de huevo y la membrana externa se hayan eliminado como se ha demostrado, cubra los huevos con una membrana de cera de parafina y coloque los huevos de nuevo en la incubadora de huevos sin rotación hasta que los ganglios de raíz dorsal estén listos para el injerto. Para el injerto de un ganglio de raíz dorsal en la membrana corioalantoica, utilice fórceps estériles finos para agarrar cuidadosamente un ganglio en el plato de cultivo y lavar suavemente el tejido en un recipiente de HBSS fresco. Coloque el ganglio sobre la membrana corioalantoica de un huevo teniendo cuidado de no perforar la membrana y cubrir todas las aberturas de huevo con apósitos estériles de película transparente.
Cuando todos los huevos hayan sido injertados, devuélvalos a la incubadora de huevos humidificador durante dos días sin rotación. Al final de la incubación, transfiera los huevos al armario de flujo laminar y utilice tijeras y fórceps para abrir el apósito de película transparente. A continuación, agregue 0,5 a un millón de células tumorales etiquetadas fluorescentemente en cinco microlitros de HBSS a la membrana corioalantoica de cada huevo a unos dos milímetros de cada ganglio de raíz dorsal manteniendo una distancia uniforme entre los ganglios y las células.
Luego cubra los huevos con un nuevo aderezo de película y devuelva los huevos a la incubadora de huevos durante siete días sin rotación. Al final de la incubación, coloque los huevos en la mesa del banco de laboratorio. Utilice una jeringa para perforar el apósito de película de cada huevo y aplique alrededor de 300 microlitros de 4%paraformaldehído sobre cada membrana corioalantoica para endurecer ligeramente el tejido y facilitar el proceso de cosecha.
Con tijeras, retire la mitad superior de la cáscara de huevo con la membrana corioalantoica unida. Reducir el tamaño de la cáscara a aproximadamente tres centímetros de diámetro manteniendo la porción de la membrana corioalantoica donde el ganglio de raíz dorsal y las células tumorales fueron injertadas dentro del centro del fragmento de la cáscara. A continuación, agarre la membrana corioalantoica con fórceps finos y desensaje el tejido de la cáscara de huevo para transferirlo en un pozo de una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de 4%paraformaldehído por ganglio de raíz dorsal y lado de la célula tumoral hacia arriba.
La integración de los ganglios de raíz dorsal en la membrana corioalantoica es importante, ya que la membrana corioalantoica proporciona nutrición al tejido ganglionar de la raíz dorsal durante el experimento. Microscópicamente, el ganglio de raíz dorsal se observa dentro del tejido conectivo de la membrana corioalantoica y los vasos sanguíneos se ven a menudo dentro del tejido ganglionar de raíz dorsal, lo que sugiere que el suministro de sangre de la membrana corioalantoica está nutriendo el tejido injertado. Los tumores implantados también se identifican en la membrana corioalantoica mediante la hematoxilina y la tinción de eosina.
Dependiendo de la cantidad de invasión presente, los tumores podrían presentarse sin a numerosas islas tumorales invadiendo el tejido conectivo. En este experimento representativo, las imágenes con el análisis de fluorescencia de fusión revelaron una invasión creciente del ganglio de raíz dorsal en las membranas corioalantoicas injertadas con células tumorales sobre la expresión del receptor de galanina 2 en comparación con el control de tumores. Este modelo in vivo útil y rentable de invasión perineural puede ser replicado incluso por laboratorios con recursos limitados.
