Dieses Protokoll ermöglicht die In-vivo-Studie über frühe Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Nerven und die Untersuchung molekularer Wege der Nerveninvasion bei Krebs. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die kurze experimentelle Zeit mit dem Potenzial, perineurale Invasion und andere Krebs-Phänotypen im selben Experiment zu studieren. Bevor Wir diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir, kommerzielle nicht befruchtete Eier zu bohren und die dorsalen Wurzelganglien zu ernten, um Ihre Technik für beide Verfahren zu optimieren.
Demonstriert wird das Verfahren von Min Liu, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Inkubation von sechs kommerziellen pathogenfreien befruchteten Eiern pro Versuchsgruppe in einem Eibefeuchter-Inkubator bei 38 Grad Celsius und 54 % Luftfeuchtigkeit am ersten Tag nach der Befruchtung für acht Tage mit stündlicher Rotation. Reinigen Sie am achten Tag die Rückenhaut einer eingeschläferten Ratte mit 70% Ethanol und entfernen Sie mit einer Schere die Wirbelsäule.
Trennen Sie die Zervix-, Brust- und Lendenbereiche und legen Sie die Wirbelsäulenabschnitte in eine 10-Zentimeter-Kulturschale mit PBS, um die Gewebeproben hydratisiert zu halten. Öffnen Sie mit einer empfindlichen Knochenschere die Brust- und Halswirbelknochen in den dorsalen und ventralen Aspekten, um die Wirbelsäule in zwei seitliche Hälften zu trennen und die Gewebeabschnitte in eine saubere 10-Zentimeter-Schale mit frischem PBS zu legen. Lösen Sie das Rückenmark mit Zangen sanft von den Wirbelknochen, um die dorsalen Wurzelganglien zu visualisieren.
Platzieren Sie die Spitzen eines Paarfeine unter jedem Ganglion gehalten, greifen Sie das Gewebe und ziehen Sie es aus der Knochenhöhle, in der es untergebracht ist. Unmittelbar nach der Ernte, legen Sie jedes Ganglion in DMEM Kulturmedium ergänzt mit 2%Penicillin und Streptomycin oder Pen-Strep und 10%fetale Rinderserum oder FBS, um bakterielle Kontamination des Nervengewebes zu verhindern. Wenn alle Ganglien geerntet sind, übertragen Sie das Gewebe in ein neues Kulturgericht mit frischem DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 2%Pen-Strep plus 10%FBS und 1,2 Mikrogramm pro Milliliter roter Fluoreszenzfarbstoff für eine einstündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator.
Um die Eier für das dorsale Wurzelganglientransplantat vorzubereiten, das Licht in einem laminaren Strömungsschrank zu verdünnen und das Ei mit dem natürlich vorkommenden Luftsack in Richtung der Lichtquelle zu halten, transilluminaten Sie jedes Ei, um die Lebensfähigkeit des Kükens und die embryonale Phase zu überprüfen. Identifizieren Sie die Befestigung des sich entwickelnden Embryos an der chorioallantoischen Membran als ein dunkles bewegliches Gefäß, das an der Eimembran befestigt ist, und verwenden Sie einen Bleistift, um die Befestigung zu markieren, um Eingriffe in dieser Region zu vermeiden. Zeichnen Sie einen 1,5-Zentimeter-Bereich in einem gut vaskularisierten Bereich mindestens zwei Zentimeter vom Embryo-Anhang entfernt, um als Operationsfensterbereich zu fungieren, und zeichnen Sie einen 0,5 Zentimeter großen Quadratmeter in einem weniger vaskularisierten Bereich etwa einen Zentimeter vom Betriebsfenster entfernt.
Markieren Sie dann die Mitte des Luftsackbereichs. Als nächstes verwenden Sie ein Drehwerkzeug und einen Gravurbohrer mit einem Bit von drei Millimetern, um die Eierschale innerhalb des markierten Quadrats sorgfältig zu bohren. Verwenden Sie stumpfe Zange, um die Eierschale zu entfernen, ohne die weiße äußere Eierschalenmembran direkt unter der Schale zu entfernen.
Verwenden Sie den Bohrer, um sorgfältig eine punktgenaue Bohrperforation im markierten Kreuz im Luftsackbereich zu machen, um Luftstrom in das Ei zu ermöglichen, ohne die Schale zu brechen oder zu beschädigen, und fügen Sie 30 Mikroliter HBSS in die quadratische Öffnung über der intakten äußeren Eierschalenmembran. Mit einer 30-Spur-Nadel eine punktgenaue Perforation in der äußeren Membran innerhalb des quadratischen Bereichs machen. Halten Sie als Nächstes das Ei bis zur Lichtquelle, um den Luftsack zu visualisieren und Druck auf eine Augentropfen-Gummilampe auszuüben.
Legen Sie die Augentropfenlampe über die kleine Perforation innerhalb des Luftsacks und lassen Sie den Druck auf die Glühbirne los, bis eine Trennung der äußeren Membran und der chorioallantoischen Membranen innerhalb des Betriebsfensterbereichs beobachtet wird, die diesen Schritt wiederholt, bis eine vollständige Trennung der Membranen erreicht ist. Wenn alle Eier auf die gleiche Weise verändert wurden, bohren Sie das kreisförmige Betriebsfenster in einem Ei und achten Sie darauf, die äußere Eierschalenmembran nicht zu brechen und verwenden Sie die klebrige Seite eines Stückklebebandes, um lose Partikel aus der Schale zu entfernen. Entfernen Sie mit stumpfer Zange die Eierschale aus dem gebohrten Bereich, gefolgt von der äußeren Eierschalenmembran, die darauf achtet, keine kleinen Schalenpartikel in das Ei einzuführen, um die Kontamination zu minimieren.
Wenn die Eierschale und die äußere Membran wie gezeigt entfernt wurden, bedecken Sie die Eier mit einer Paraffinwachsmembran und legen Sie die Eier ohne Rotation wieder in den Eierbrutkasten, bis die dorsalen Wurzelganglien zur Veredelung bereit sind. Für die Veredelung eines dorsalen Wurzelgangliens auf die chorioallantoische Membran verwenden Sie feine sterile Zangen, um ein Ganglion in der Kulturschale sorgfältig zu erfassen und das Gewebe vorsichtig in einem Behälter mit frischem HBSS zu waschen. Legen Sie das Ganglion auf die chorioallantoische Membran eines Eis und achten Sie darauf, die Membran nicht zu durchstechen und alle Eiöffnungen mit sterilen transparenten Filmverbänden zu bedecken.
Wenn alle Eier gepfropft sind, bringen Sie sie für zwei Tage ohne Rotation in den Befeuchtungs-Ei-Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation die Eier in den laminaren Fließschrank geben und mit Schere und Zange den transparenten Folienverband öffnen. Als nächstes fügen Sie 0,5 bis eine Million fluoreszierend markierte Tumorzellen in fünf Mikrolitern HBSS auf die chorioallantoische Membran jedes Eis etwa zwei Millimeter von jedem dorsalen Wurzelganglion hinzu, das einen gleichmäßigen Abstand zwischen den Ganglien und den Zellen hält.
Dann die Eier mit einem neuen Filmdressing bedecken und die Eier sieben Tage lang ohne Rotation in den Eierbrutkasten zurückgeben. Am Ende der Inkubation die Eier auf die Laborbank oben legen. Verwenden Sie eine Spritze, um das Filmdressing jedes Eis zu perforieren und etwa 300 Mikroliter 4%Paraformaldehyd über jede chorioallantoische Membran aufzutragen, um das Gewebe leicht zu versteifen, um den Ernteprozess zu erleichtern.
Entfernen Sie mit einer Schere die obere Hälfte der Eierschale mit der chorioallantoischen Membran. Reduzieren Sie die Größe der Schale auf etwa drei Zentimeter im Durchmesser, wobei der Teil der chorioallantoischen Membran erhalten bleibt, in dem dorsale Wurzelganglion und Tumorzellen in der Mitte des Schalenfragments transplantiert wurden. Dann greifen Sie die chorioallantoische Membran mit feiner Zange und lösen Sie das Gewebe von der Eierschale für den Transfer in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern 4%Paraformaldehyd pro Brunnen dorsalwurzelGanglion und Tumorzelle Seite nach oben.
Die Integration von dorsalen Wurzelganglien in die chorioallantoische Membran ist wichtig, da die chorioallantoische Membran dem dorsalen Bandliengewebe während des Experiments Nahrung liefert. Mikroskopisch wird das dorsale Wurzelganglion im Bindegewebe der chorioallantoischen Membran beobachtet und blutgefäße werden oft im dorsalen Bandliengewebe gesehen, was darauf hindeutet, dass die chorioallantoische Membranblutversorgung das transplantierte Gewebe nährt. Implantierte Tumoren werden auch auf der chorioallantoischen Membran durch Hämatoxylin- und Eosinfärbung identifiziert.
Je nachdem, wie viel Invasion vorhanden ist, können Tumore ohne zahlreiche Tumorinseln vorhanden sein, die in das Bindegewebe eindringen. In diesem repräsentativen Experiment ergab die Bildgebung mit Dermergefluoreszenzanalyse eine erhöhte Invasion des dorsalen Wurzelgangliens in chorioallantoischen Membranen, die mit Tumorzellen transplantiert wurden, anstatt den Galaninrezeptor 2 im Vergleich zu Kontrolltumoren auszudrücken. Dieses nützliche und kostengünstige In-vivo-Modell der perineuralen Invasion kann auch von Laboratorien mit begrenzten Ressourcen repliziert werden.
