Bu protokol tümör hücreleri ve sinirler arasındaki erken etkileşimlerin in vivo çalışma ve kansersinir invazyonunmoleküler yollarının çalışma sağlar. Bu tekniğin başlıca avantajları, aynı deneyde perinörin invazyon ve diğer kanser fenomenlerinin incelenmesi potansiyeline sahip kısa deneysel zamandır. Bu tekniği ilk kez denemeden önce, her iki işlem için de tekniğinizi optimize etmek için ticari döllenmemiş yumurtaları delme ve sırt kökü gangliyonu hasat etme alıştırması yapmanızı öneririz.
Prosedürü gösteren Min Liu, benim laboratuvar bir araştırma görevlisi olacaktır. Deney grubu başına altı ticari patojeniçermeyen döllenmiş yumurtayı, 38 santigrat derecede nemlendirici bir kuluçka makinesinde ve ilk gün gübreleme sonrası sekiz gün boyunca saatlik dönüşle %54 nemle kuluçkaya yatırArak başlayın. Sekizinci günde, %70 etanol ile ötenazi yapılan bir farenin sırt derisini temizleyin ve omurgayı çıkarmak için makas kullanın.
Servikal, torasik ve lomber bölgeleri ayırın ve doku örneklerini nemli tutmak için omurga bölümlerini PBS ile 10 santimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin. Hassas kemik makas kullanarak, sırt ve ventral yönleriyle göğüs ve servikal vertebra llerini açın, omurgayı iki lateral yarıya ayırın ve doku kesitlerini taze PBS ile temiz 10 santimetrelik bir tabağa yerleştirin. Forseps kullanarak, omurilik yavaşça omurga kemiklerinden dorsal kök ganglions görselleştirmek için ayırmak.
Her ganglion altında tutulan ince forseps bir çift ipuçları yerleştirerek, doku kavramak ve içinde sıkışmış olduğu kemik boşluğundan çekin. Hasattan hemen sonra, sinir dokularının bakteriyel kontaminasyonunu önlemeye yardımcı olmak için her ganglion'u %2 penisilin ve streptomisin veya Pen-Strep ve %10 fetal sığır serumu veya FBS ile desteklenen DMEM kültür ortamına yerleştirin. Tüm ganglia hasat edildiğinde, hücre kültürü kuluçka bir saatlik kuluçka için kırmızı floresan boya mililitre başına 1.2 mikrogram% Pen-Strep artı% 10 FBS ve 1.2 mikrogram ile desteklenen taze DMEM kültür ortamı içeren yeni bir kültür çanak içine dokuları aktarın.
Dorsal kök ganglion greft için yumurta hazırlamak için, bir laminar akış kabiniçinde ışık karartmak ve ışık kaynağına doğru doğal olarak oluşan hava kese ile yumurta tutarak, civciv canlılık ve embriyonik faz kontrol etmek için her yumurta transilluminate. Gelişmekte olan embriyonun koroyoallantoik membrana bağlılığını yumurta zarına bağlı koyu hareketli bir kap olarak tanımlayın ve bu bölgeye müdahaleden kaçınmak için eki işaretlemek için bir kalem kullanın. Bir çalışma penceresi alanı olarak hareket etmek için embriyo eki en az iki santimetre iyi vaskülarize bir alanda 1,5 santimetre lik bir bölge çizin ve çalışma penceresinden yaklaşık bir santimetre daha az vaskülarize bir alanda 0,5 santimetre kare çizin.
Sonra hava kese bölgesinin merkezini işaretleyin. Daha sonra, işaretli kare içinde yumurta kabuğunu dikkatlice delmek için üç milimetre çapında bitli döner bir alet ve gravür matkabı kullanın. Kabuğun hemen altındaki beyaz dış yumurta kabuğu zarını çıkarmadan yumurta kabuğunu çıkarmak için künt çözgükullanın.
Hava kesesi alanında işaretli haçta dikkatlice matkap delinme yapmak için matkabı kullanın, böylece kabuğu kırmadan veya zarar vermeden yumurtaya hava akışına izin verin ve bozulmamış dış yumurta kabuğu zarının üzerindeki kare açıklığa 30 mikrolitre HBSS ekleyin. 30 gauge iğne kullanarak, kare alan içinde dış membran bir nokta delik yapmak. Daha sonra, hava kesesini görselleştirmek ve bir dropr kauçuk ampul basınç uygulamak için ışık kaynağına kadar yumurta tutun.
Hava keseiçinde küçük perforasyon üzerine dropr ampul yerleştirin ve çalışma penceresi alanı içinde dış membran ve koryoallantoik membranların bir ayrım kadar ampul üzerinde basınç serbest membranlar tam bir ayrım elde edilene kadar bu adımı tekrargözlenir. Tüm yumurtalar aynı şekilde modifiye edildiğinde, dış yumurta kabuğu zarını yırtmamaya özen gösteren dairesel çalışma penceresini delin ve yapışkan bant parçasının yapışkan tarafını kullanarak kabuktaki gevşek parçacıkları çıkarın. Künt forceps kullanarak, kontaminasyonu en aza indirmek için yumurta içinde küçük kabuk parçacıkları tanıtmak için dikkat ederek dış yumurta kabuğu membran takip delinmiş alandan yumurta kabuğu kaldırın.
Yumurta kabuğu ve dış zar gösterildiği gibi çıkarıldığında, bir parafin balmumu membran ile yumurta kapağı ve dorsal kök ganglia aşılama için hazır olana kadar dönmeden yumurta kuluçka içine geri yumurta yerleştirin. Koryoallantoik membran üzerine bir dorsal kök ganglion aşılama için, dikkatle kültür çanak bir ganglion kavramak ve yavaşça taze HBSS bir kap içinde doku yıkamak için ince steril forseps kullanın. Bir yumurtanın koroyoallantoik membran üzerine ganglion yerleştirin membran delmek için dikkatli olmak ve steril şeffaf film pansumanları ile tüm yumurta açıklıkları kapsayacak şekilde.
Tüm yumurtalar aşılandığında, iki gün boyunca dönmeden nemlendirici yumurta kuluçka makinesine geri dönün. Kuluçka sonunda, laminar akış kabine yumurta aktarın ve şeffaf film pansuman açmak için makas ve forceps kullanın. Daha sonra, her bir dorsal kök ganglion yaklaşık iki milimetre her yumurtanın koryoallantoik membran üzerine HBSS beş mikrolitre içinde bir milyon floresan etiketli tümör hücreleri ekleyin ganglia ve hücreler arasında düzgün bir mesafe tutmak.
Sonra yeni bir film sosu ile yumurta kapağı ve dönmeden yedi gün boyunca yumurta kuluçka yumurta dönmek. Kuluçka sonunda, laboratuvar tezgah üst üzerine yumurta yerleştirin. Her yumurtafilm pansuman delik ve hasat sürecini kolaylaştırmak için doku biraz sertleştirmek için her koryoallantoik membran üzerinde% 4 paraformaldehit yaklaşık 300 mikrolitre uygulamak için bir şırınga kullanın.
Makas kullanarak, koroallantoik membran bağlı yumurta kabuğunun üst yarısını çıkarın. Kabuk boyutunu yaklaşık üç santimetre çapında dorsal kök ganglion ve tümör hücreleri kabuk parçasının merkezi içinde aşılanmış koroallantoik membran kısmını tutarak azaltmak. Sonra ince forseps ile koryoallantoik membran kavramak ve iyi dorsal kök ganglion ve tümör hücre tarafı başına% 4 paraformaldehit iki mililitre içeren altı iyi plaka bir kuyuya transfer için yumurta kabuğundan doku ayırmak.
Koroallantoik membran ile dorsal kök gangliyonunun entegrasyonu, deney sırasında dorsal kök ganglion dokusuna beslenme sağladığı ndan önemlidir. Mikroskopik olarak, koroallantoik membran bağ dokusu içinde dorsal kök ganglion gözlenir ve kan damarları genellikle koroallantoik membran kan akımı aşılanmış doku besleyen olduğunu düşündüren dorsal kök ganglion doku içinde görülür. İmplante edilen tümörler de hematoksilin ve eozin boyama ile koryoallantoik membran üzerinde tanımlanır.
Ne kadar invazyon mevcut bağlı olarak, tümörler bağ dokusu işgal çok sayıda tümör adaları no ile mevcut olabilir. Bu temsili deneyde, birleştirme floresan analizi ile görüntüleme, kontrol tümörleri ile karşılaştırıldığında galanin reseptör2 ifade üzerinde tümör hücreleri ile aşılanmış koryoallantoik membranlarda dorsal kök ganglion artan bir invazyon ortaya koymuştur. Perinör invazyonun vivo modelinde bu yararlı ve uygun maliyetli, sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar tarafından bile çoğaltılabilir.
