نود أن نشكر ريبيكا باكيت للمساعدة في تحضير كاشف. معتمد من قبل MPM زمالة روث Kirchstein L. predoctoral من المعاهد الوطنية للصحة ودعم من المنح GM - 41514 (MDC) ، NS - 48252 (KGC) ، GM - 48071 (IP) أيضا من المعاهد الوطنية للصحة.

1. نقل بالتبني من الخلايا : الذيل الوريد أو حقن العين كلاهما الطرق المناسبة لتطبيق تعقب الخلية التي تحمل علامات أو التعبير عن بروتين فلوري الخلايا الليمفاوية. في هذا الفيديو. نظهر نقل بالتبني من الخلايا عن طريق الحقن في الوريد الذيل. أ. المواد تغسل CD4 + المسماة الخلايا التائية مع 1.4 ميكرومتر CFSE لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مرتين ، وإعادة علقت في 100 ميليلتر من RPMI - 1640. يتم تحميل الخلايا في المحاقن المعقمة 28 قياس الانسولين عن طريق الحقن. عدد الخلايا المستخدمة يعتمد على يجري التجربة. عادة ، 5 ملايين الخلايا التائية بسيطة تكفي لتصور الخلايا التائية. وثمة حاجة إلى restrainer القوارض للماوس لمنع إصابة الحيوان ولنفسك. ب. تأمين الحيوان يتم تأمين الماوس لنقل بالتبني من خلال دعم ببطء الحيوان في restrainer القوارض (انظر الفيديو) وإغلاق النهاية المفتوحة للأنبوب بالضغط بلطف المكبس. لا يتخلين عن ذيل الماوس أثناء هذه العملية ، حيث أن بعض الحيوانات الصغيرة يمكن أن تتحول نحو داخل restrainer. هذا الأسلوب يمنع الحيوان من اصابة نفسها وتتحرك من خلال الحقن. عند إعداد restrainer القوارض ، لا دفع المكبس في أبعد مما هو ضروري للحفاظ على الحيوانات من القفز إلى الأمام. أيضا ، لا دفع المكبس ضد الحيوان ، وعدم ترك الحيوان في restrainer لفترة ممتدة من الزمن. ج. تصور السياق الذيل برفق نحو الذيل لك بحيث يتم التفاف طفيفة عليه أكثر من إصبع السبابة الخاص وعقد ضد من الداخل بواسطة إصبع الإبهام. التعرف على الأوردة ذيل تقع على جانبي الذيل في وضع مستقيم. ومما يسهل التصور عن الاحترار الذيل بالماء الدافئ ، ثم مسح أسفل مع الايثانول. د. حقن الخلايا عندما تم تحديد موقع الوريد ، تضاف شطبة حقنة من جانب مواز يصل في زاوية الضحلة إلى الوريد. مرة واحدة في هذا السياق ، خفض بلطف الغطاس ، وإذا كنت في هذا السياق ينبغي أن يكون هناك أي مقاومة للحقن. إذا كان هناك أي مقاومة ، وإزالة المحقنة وحاول مرة أخرى في موقع مختلف. إذا كنت في هذا السياق ، خفض ببطء الغطاس حتى اكتمال الحقن. يجب أن لا تصبح منتفخة الذيل خلال الحقن. إذا كان الأمر كذلك ، فإن هذا يعني أن إبرة ليس في الوريد. فمن الممكن أن &quot;فقدان&quot; في الوريد خلال الحقن. إذا حدث هذا ، إزالة الإبرة وحاول الحقنة في مكان مختلف. إذا كنت في حاجة لمحاولة أكثر من حقنة واحدة ، فمن الأفضل لتحريك الذيل يصل نحو جسم الفأر من موقع الحقن الأصلي. تخطط للمستقبل لهذا الاحتمال من خلال البدء بشكل أقصى على الذيل أن تعطي لنفسك مجالا لمحاولة أخرى لنقل بالتبني. ه. بعد حقن الاعتبارات بعد الانتهاء من الحقن ، وسوف صغير يعود تدفق الدم من الوريد تحدث. اضغط بلطف موقع الحقن مع مسح نظيفة ، وحتى يتوقف النزيف. إزالة المكبس ، والسماح للحيوان السير إلى الأمام ، للخروج من restrainer ، بينما يمسك بلطف على الذيل. الاختيار دائما مع الخاص جنة رعاية الحيوان والبروتوكولات استخدام الحيوانات للتأكد من وجودك في الامتثال. من المهم أن ممارسة هذا الأسلوب عدة مرات قبل محاولة التجربة الحقيقية. 2. العقدة اللمفية العزل عزلة الغدد الليمفاوية للتصوير الفوتون two يتطلب إزالة حذرا من العقدة الليمفاوية الصحيحة من الأنسجة المحيطة بها. أ. اختيار ومكان الغدد الليمفاوية الطرفية واختيار الغدد الليمفاوية للتصوير تعتمد على أهداف تجريبية. يكون على بينة من عدوى محلية أو الحقن تجفيف الغدد الليمفاوية ، وحدد العقدة المناسبة للتصوير. المقالة التي كتبها فان دن Broeck وآخرون ، ويصف موقع ومورفولوجية الغدد الليمفاوية الفئران بالتفصيل 3. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح الختان ستة كبيرة الغدد الليمفاوية الطرفية التي هي مناسبة لعزل الخلية أو التصوير. ب. إزالة العقدة الليمفاوية : نأخذ في الاعتبار سلامة الأنسجة مع إزالة الغدد الليمفاوية. يجب الحرص على عدم القطيعة الكبسولة أو في أي ضرر الطريقة بنية العقدة الليمفاوية. وفقدان النزاهة العقدة الليمفاوية التسوية الهيكلية التجربة. إذا لزم الأمر ، وإزالة الدهون من سطح العقدة الليمفاوية مع غرامة ملقط تشريح (# 5 دومون) تحت مجهر تشريح. وينبغي أن الغدد الليمفاوية ليس لديها أي الدهون المتبقية على سطح العقدة ، لأن هذا سوف تحجب التصوير التي تشتت الضوء. استئصال الغدد الليمفاوية السليم هو أيضا مهم لممارسة أسلوب قبل التجربة الحقيقية الأولى. 3. الليمفاوية الإيماءةه التصوير إعداد واعتبارات وينبغي تأمين العقدة الليمفاوية الى مرحلة التصوير ، وهو في هذه الحالة يتكون من غرفة راحة. ويتم ضخ تحسنت ، والأكسجين ، perfused الوسائط في الغرفة من جانب واحد باستخدام مضخة تمعجية وسخان المضمنة ، وخروجها عبر قناة متدرج نحو الانخفاض ، في غرفة جمع مع فراغ أنبوب لجمع النفايات القارورة. في نظامنا ، الغارقة في العقدة الليمفاوية في 37 درجة مئوية وسائل الإعلام وفائقة perfused مع كربوجين الصف الطبية (5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ O 2). يجب أن تسجل درجة الحرارة في وسائل الاعلام نضح أقرب إلى العقدة الليمفاوية ما هو ممكن. قد يتطلب النظام الخاص بك ولا سيما التغيرات في معدل تدفق وسائل الإعلام ومرحلة التصميم لاستيعاب المرحلة المجهر وموضوعية. أ. العقدة الليمفاوية الإعداد والتصوير : كما يظهر في شريط الفيديو ، ونحن أمنا العقدة الليمفاوية عن طريق ربط لأول مرة ، من جانب النخاعية أسفل (صورة لخلية تي أو مناطق B باستخدام المجهر تستقيم) إلى ساترة البلاستيك ، وقطع إلى الحجم المناسب. من المهم استخدام الغراء الأنسجة غير سامة (نستخدم VetBond ™ من شركة 3M). يتم تأمين ساترة في وسائل الإعلام التي تتدفق من خلال وضع لمسة صغيرة من الشحوم سيليكون على الجانب السفلي من انزلاق الغطاء ، ثم وهذا الالتزام إلى قاعدة من الزجاج للغرفة التصوير. ب. 2 فوتون الاعتبارات التصوير : ويمكن لعوامل عديدة تسبب الخلايا الليمفاوية لوقف التحرك : درجة الحرارة التي هي مرتفعة جدا أو منخفضة جدا ؛ فائض قوة الليزر ؛ ضغط أو أضرار أخرى إلى العقدة الليمفاوية ، ونقص الأوكسجين. الضرر الناجم عن قوة الليزر أو درجات الحرارة المفرطة&gt; ~ 39 درجة مئوية لا رجعة فيه. إذا الخلايا قاتمة ، فمن الأفضل عادة لزيادة الحصول على كشف الخلية أو بروتوكول وضع العلامات بدلا من استخدام القوة العالي ليزر لتصور الخلايا. قد تكون هناك حاجة لوضع العلامات التحسين أو التعبير عن البروتينات الفلورية لجلب مضان فوق مستوى الخلفية تألق ذاتي. مع زيادة معقولة وإعدادات الطاقة الليزر ، وتحولا نحو عامين سجل لمضان فوق خط الأساس (يقاس التدفق الخلوي) هو التصور المعقول للخلية. مع الليزر ثنائي الفوتون الانضباطي ، ينبغي أن تستخدم لإثارة موجة تكون أقل قليلا من ضعف الحد الأقصى الإثارة واحدة من الفوتون fluorophore التي يجري تصويرها. في اثنين من الفوتون التجارب باستخدام أكثر من تسمية واحدة أو بروتين فلوري قد يكون من الضروري لهذه التجربة مع موجة الإثارة استخدامها للعثور على الإعدادات المثلى لكل من التسميات. ويمكن أيضا إثارة ثنائي الفوتون يمكن استخدامها لهياكل صورة الكولاجين الذاتية عن طريق الاستفادة من الجيل الثاني الزرقاء الجوهرية التوافقي. الجيل الثاني التوافقي (SHG) يحدث حيث يتم الجمع بين اثنين الفوتونات ضمن المواد وتنبعث من فوتون واحد من تردد مرتين من الفوتونات الأصلي. في الأنسجة ، واثنين من الفوتون الإثارة يحدث عندما يكون هناك ضوء الليزر الحادث هو عمودي على بنية البروتين أمر غاية مثل الكولاجين. وتمت مناقشة القضايا العملية المتعلقة اثنين الفوتون التصوير في الاستعراضات معاينة 4 ، 5.

<ol>
	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

في هذا البروتوكول الفيديو نظهر الإجراءات لنقل الخلايا الليمفاوية بالتبني وعقدة العزلة والتحضير اللازم لمفاوية حركية التصوير في العقدة الليمفاوية الطرفية. ثنائي الفوتون التصوير ديها العديد من المزايا أكثر من التصوير في كل من أنسجة مبائر explanted (كما هو موضح هنا) وintravital في التحضيرات. خصوصا ، واستخدام الأشعة تحت الحمراء يقلل الإثارة تشتت الضوء وتسمح للتصوير ~ 300 ميكرومتر تحت الكبسولة من العقدة الليمفاوية وأعمق في بعض الأنسجة 4. وعلاوة على ذلك ، يقتصر متعدد الفوتون الإثارة إلى النقطة المحورية لهذا الهدف ، وتبيض الصورة تقليل تلف الأنسجة من جانب الطائرة التنسيق. كما هو الحال مع أي تقنية جديدة ، ومع ذلك ، واثنين من الفوتون التصوير ليست حلا سحريا ، ويجب أن تبقى حدودها والمزالق المحتملة في الاعتبار 5. بين هذه هو شرط ذلك -- باستثناء اشارات الجوهرية مثل الجيل الثاني التوافقي بواسطة خلايا الكولاجين الفائدة يجب أن تكون التحقيقات التي fluorescently المسمى خارجي أو من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية. وبالتالي يتم إنشاء الانطباع بأن هذه الخلايا هي المسمى السباحة في فراغ أسود ، بينما في الحقيقة هي أنها منغمسة في ، والتفاعل مع بيئة معقدة من العناصر الهيكلية وغيرها غير المسماة لا تعد ولا تحصى ، والخلايا غير مرئية. في السنوات الست منذ بدء اثنين من الفوتون التصوير لالمناعة ، وسمحت هذه التقنية الباحثين لمعالجة طويلة الأمد الأسئلة التي تصور بشكل مباشر في سلامة الأنسجة الحية بما في ذلك عمليات الخلية خلية التفاعلات ، وحركية الخلية والتوطين ، مما يشير مسارات الخلوية السامة للخلايا والخلية مقتل الأحداث. وقد تطورت بسرعة تتجاوز مجال توصيف الظواهر الأولية ، والتحليل الكمي مع النمذجة والمحاكاة الكمبيوتر بدأت الآن لفهم كيف أن الحركات الفوضوية يبدو الخلوية والتفاعلات داخل الغدد الليمفاوية يؤدي إلى استجابة مناعية فعالة. ويتم استعراض شامل هذا التقدم في منشور صدر مؤخرا 1 ، الذي يسرد ما يزيد على 100 ​​ورقات واصفا طلب من اثنين من الفوتون المجهري للimmunoimaging.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

وقد كشف اثنان الفوتون تصويري شامل للالكوريغرافيا أنيقة من حركية والتفاعلات الخلوية في العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية في بدء استجابة مناعية 1. هنا ، فإننا نقدم طرق لنقل بالتبني من الخلايا التائية المسمى ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة من التصوير خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted كما هو موضح الأولى في عام 2002 2. التصوير ثنائي الفوتون من الخلايا المناعية التي تتطلب fluorescently المسمى الخلايا ، إما عن طريق تلوين مع خلية الصبغة أو تعقب بالإعراب عن بروتين فلوري. علينا أن نظهر للإجراءات نقل بالتبني من الخلايا المشتقة من حقن الفئران المانحة في الوريد ذيل الحيوان المتلقي ، حيث أنها موطن لأجهزة اللمفاوية ضمن 15-30 دقيقة تقريبا. نوضح العزلة من العقدة الليمفاوية وتصف وسائل لضمان التركيب الصحيح للالعقدة الليمفاوية استئصاله. وتناقش اعتبارات أخرى مثل الأوكسجين المناسب من وسائل الإعلام perfused ودرجة الحرارة وقوة الليزر. وأخيرا ، فإننا نقدم لصور الفيديو 3D CD4 + الخلايا التائية السذاجة العارضة المطرد حركية الدولة في 37 ° C.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice at JoVE.com

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

وكشف اثنان الفوتون التصوير حركية اللمفاويات والتفاعلات الخلوية داخل العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية خلال استجابة مناعية 1. هنا ، علينا أن نظهر نقل بالتبني من الخلايا التائية ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة التصوير من خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted.

تشريح و 2 الفوتون التصوير من العقد الليمفاوية الطرفية في الفئران

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

46.0K Views.  University of California, Irvine (UCI).  وكشف اثنان الفوتون التصوير حركية اللمفاويات والتفاعلات الخلوية داخل العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية خلال استجابة مناعية 1. هنا ، علينا أن نظهر نقل بالتبني من الخلايا التائية ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة التصوير من خلايا CD4 + T ف...

Video: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

A - 2 لأسلوب التصوير فوتون من تدفق الدم في القشرة المخية الحديثة من خلال نافذة القحف

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

وظيفية التصوير الشحوم البنية في الفئران مع micro-PET/CT FDG

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

Micropuncture of Bowman&#039;s Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

ميكروبونكتوري الفضاء بومان في الفئران التي يسرتها 2 فوتون مجهرية

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...