ويدعم هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من لجنة التحقيق الوطنية 1R01CA154656، NIAID 1R21AI092299، معهد بحوث السرطان، مؤسسة سانت Baldrick، ومؤسسة دانا، مؤسسة غابرييل في الملاك، وهيونداي موتورز الأمريكية &quot;الأمل على اساس عجلات&quot; البرنامج.

1. فأر حامل الجمعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب غطاء صحن 100 ملم بيتري الزجاج على رأس 100 مم من البلاستيك غطاء طبق بيتري أسفل. يجب أن يكون زجاج لمس بالكاد نقطة وسط طبق من البلاستيك. استخدام الزجاج واستنسل، تتبع علامة على طبق من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحفر اليد (أي DREMEL) لإزالة جزء من غطاء 100 مم طبق من البلاستيك لخلق منصة على شكل هلال. وهذا غطاء من البلاستيك على شكل هلال بمثابة دعم الجذع العلوي من الفأرة (الشكل 1A). حفر اثنين من الثقوب على غطاء على شكل هلال لتأمين قناع غاز مع معدن التعادل تطور. تأمين غطاء من البلاستيك على حافة طبق بيتري الزجاج باستخدام الغراء عظمى أو لاصق قوي مكافئ (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء الأغطية اثنين من القبة الحد الأقصى للأنابيب PCR (قطع في المفصل) 1 سم بعيدا إلى وسط الطبق أسفل لغرض رسو اللوحات الجلد المأبضية. </li></ol> 2. فأر التحضير <stroنانوغرام&gt; ملاحظة: مع ممارسة ما يكفي، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على أداء وإعداد الماوس والخطوات الجراحية في 20-30 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس مع isoflurane (2 إلى 2.5٪ لتحريض، 1.5 إلى 2٪ للجراحة / التصوير) ممزوجين في 01:01 O 2: خليط الهواء بمعدل تدفق 1L/min باستخدام إجراء IACUC التي وافق عليها. وبمجرد أن الفأر هو تخدير، وتأمين قناع غاز على الأنف مع الشريط. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل بسبب عدم وجود استجابة إلى أخمص القدمين و / أو القرصات الذيل. ويمكن تعديل مستوى isoflurane وفقا لذلك لضمان مخدرا تماما الحيوان، وذلك، غير ثابت، جاهد معدل التنفس بين 60-80 الأنفاس / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الانتهازي الكهربائية لإزالة الشعر في الساق الخلفية اليمنى والمنطقة الاربية من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرشاة الشعر بعيدا فضفاضة وتطبق بلطف معطفا متواضع من محلول نير على منطقة حليق مع مسحة القطن. بعد دقيقة واحدة من التطبيق الأولي، وإزالة نير وتنظيف البشرة المكشوفة مع مبللةمنشفة ورقية. تأكد من أن الفأر هو نظيفة وجافة قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق صغير مم 2-3 مع مقص في الركبة اليمنى لفضح وتر الباسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبق Vetbond على طول وسط حامل الماوس حيث سيتم وضع الجسم الماوس وساق. تأمين بعناية الماوس على حامل، مع الركبة اليمنى لأسفل، للكشف عن الحفرة المأبضية حق. تأمين وتر الركبة اليمنى مع Vetbond في ما بين أصحاب البشرة رفرف 2 للمساعدة في استقرار مجال التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتمتد والشريط الذراعين والساق اليسرى للمنصة العليا للحامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التعادل لضمان تطور قناع غاز في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حامل تحت المجهر تشريح. يجب أن LN لا تزال على الاطلاق، بغض النظر عن حركة التنفس من الفأرة. ولذلك، يجب اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ عملية جراحية لتحسين الاستقرار في الساق. تحديد موقف من الذيل (عادة فوق الرأس) التي من شأنها أن تسهم في أعظمالاستقرار في الساق اليمنى والشريط أسفل الذيل. </li></ol> 3. عملية جراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين ضمن نطاق تشريح، والحفاظ على درجة حرارة الجسم فأر باستخدام سخان الفضاء أو وسادة التدفئة. للتصوير الناجح للLN المأبضية، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على درجة حرارة الجسم السليم في جميع أنحاء عملية جراحية، وكذلك للحفاظ على رطوبة الأنسجة من خلال تطبيق برنامج تلفزيوني باستمرار الحارة للنسيج عرضة للخطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الجلد مع Betadine. باستخدام مقص العقيمة، وجعل شق خط الوسط من خلال الجلد في حق منتصف الساق، ومواصلة تقطيع عموديا إلى الجزء العلوي من الفخذ الأيمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين من الشقوق الجلدية الأفقي أعلى من خط شق عمودي لإنشاء اللوحات الجلد على جانبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع والغراء أسفل كل اللوحات الجلد مع Vetbond. وسوف تشد الجلد مشدود قبل تطبيق Vetbond تعزيز الاستقرار في الساق، ولكن تأكد من أن التوتر الجلد لا تسد تدفق الدم (أي التغيرات في vesseلون لتر أو القطر). تواصل الغراء أسفل مناطق أخرى من الجلد لضمان الاستقرار في الساق قبل تعريض LN. وسوف حجم الفأر تحديد مدى الحاجة إلى الجلد الزائد الغراء أسفل. عادة، فإن أكبر الفئران يتطلب أن تكون لاصق المزيد من الجلد لحاملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن LN تقع ضمن المبأبضية إما إلى اليمين أو اليسار من الوريد المأبضي، اعتمادا على موضع الماوس على حامل. بعناية فصل LN من الأنسجة الدهنية والعضلات المحيطة باستخدام الجزئي تشريح الملقط والملقط. للتقليل من النزيف والصدمات النفسية، واستخدام التقنيات التفلطح مع الدقيقة تشريح الملقط إلى أنسجة منفصلة. فضح بعناية LN المأبضية دون تعريض سلامة الأوعية الدموية وارد وصادر والأوعية اللمفاوية وارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للاستقرار النسيج واضاف، قد يتم وضع كوب غطاء مربع خلال LN رطبة، مجرد لمس بالكاد LN مع تجنب انسداد الأوعية. قد تكون غطاء زجاجي معالج الأمانإد مع نماذج من الطين على جانبي الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إدخال الأصباغ الفلورية سفينة من مختلف الأحجام (على سبيل المثال، TRITC دكستران، والحد الأدنى من 70kDa) عن طريق الوريد في هذه المرحلة للمساعدة في تسليط الضوء على العلاقة الهيكلية وسلامة LN أثناء التصوير. </li></ol> 4. 2-الفوتون التصوير اكتساب ** <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تتعرض على نحو كاف LN ويتم تحقيق الاستقرار، ونقل على وجه السرعة لصاحب الماوس كامل الجمعية على خشبة المسرح المجهر مزودة ردود الفعل درجة الحرارة للبرمجة وسادة التدفئة للرقابة في دائرة المجهر البيئية أبقى عند 37 درجة مئوية. إضافة عقيم يكفي دافئ (37 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني أو HBSS لغمر LN. فإن حجم تغيير اعتمادا على حجم والتنسيب من الفأرة. بدلا من ذلك، قد يتم تطبيق برنامج تلفزيوني دافئ أو HBSS مباشرة إلى LN تشريح من خلال ماصة الزجاج غرامة لتركيب المضخات التمعجية ومسجلة على عمود من الغمر هدف عدسة. وينبغي أن تدفق السائل يكون مثل أنيمكن الحفاظ على استقرار عمود الماء بين العدسة والنسيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على برنامج تلفزيوني أو درجة الحرارة HBSS عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة مع لجنة التحقيق التعليق. يجب وضع مسبار درجة الحرارة في فصل صاحب الماوس للتأكد من درجة الحرارة في برنامج تلفزيوني في نطاق 36.5 إلى 37.5 درجة مئوية. ويمكن أيضا تحقيق المستقيم يمكن استخدامها لمراقبة درجة حرارة الجسم الأساسية من الفأرة التجريبية طوال الدورة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برنامج التحصين الموسع، مصباح فلورسنت للمساعدة في وضع دليل LN تحت هذا الهدف. الحصول على مداخن صورة فلوري باستخدام الفواصل الزمنية التي هي مناسبة للتفاعل الخلوي المطلوب (عادة 10 ثانية إلى 1 دقيقة بين كل كومة صورة س ع ص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد حالة الحيوان في غرفة المجهر في كثير من الأحيان عن طريق التفتيش البصري أو باستخدام نظام رصد الحيوانات. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل بسبب عدم وجود استجابة إلى أخمص القدمين و / أو القرصات الأظافر، وثابت، وغير معمول معدل التنفس بين 60-80 بreaths / دقيقة. ويمكن تعديل مستوى isoflurane وفقا لذلك لضمان أن يتم تحت التخدير الكامل للحيوان. مع الرصد السليم والماء، ويمكن تصوير الحيوانات لمدة 4-6 ساعات، أو ربما أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجربة والتصوير، والموت ببطء الحيوان في غرفة CO 2 باستخدام IACUC التي وافق عليها بروتوكول القتل الرحيم. لا ينبغي أن يسمح للحيوان من أجل الخروج من التخدير قبل القتل الرحيم. </li></ol> * قد يكون هذا الإجراء الجراحي يكون من المفيد أيضا لأشكال أخرى من التصوير intravital بخلاف LSM-2P. 5. ممثل النتائج يتم تجنيد مختلف خلايا المناعة المنتشرة في LN بمعدلات مختلفة بعد نقل بالتبني. لCD4 + و CD8 + الخلايا اللمفية، وهذه الخلايا تبدأ في الوصول إلى LN من خلال ارتفاع البطانية دقيقة (اتش اى فى) الوريد بعد نقل الرابع مع ​​أعداد كبيرة وصوله الى LN المأبضية بعد 2 إلى 4 ساعات 6،17-18. لباء سلليرة سورية، وعدد كبير تتراكم بعد 8 إلى 24 ساعة 19. وينبغي أن البلدان النامية المنشط تبدأ في الظهور في استنزاف المأبضية ساعات 8-16 LN بعد حقن 3،11،16-17 قاطع الطريق. 2A الرقم يدل على ان حتى من دون معالم أخرى، يمكن تمييز هياكل مثل بصيلات الخلية B بسهولة عن طريق تراكم خلية كروية جولة مرئية تحت 2P-LSM 19. باستخدام مراسل الذاتية فلوري مثل splenocytes ubiquitin-GFP (الشكل 2، فيديو إضافي 1 و 2)، يمكن للمرء أن تتبع هذه الهجرات اللمفاويات والسلوكيات لعدة أيام تصل إلى أسبوع في ظل الظروف الفسيولوجية غير المحفزة. مع متعدد القنوات للكشف عن حساسية عالية، فمن الممكن الحصول على بيانات التصوير المتعدد الذي يشمل المعلومات الهيكلية، فضلا عن دينامية التفاعل بين الشركاء الخلوية متعددة 17،19. عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح التقنيات الجراحية والظروف البيئية رصدها بعناية، lymphocyوينبغي أن قسم التدريب والامتحانات يحمل سمة السرعة والهجرة، وكما هو موضح في الشكل 2C، 2D و 13-14،16 في مكان آخر. الخلايا اللمفية قد يحمل أيضا اختلافات في سرعة الهجرة تبعا لمناطق فرعية من التصوير LN تمر، وسوف معالم إضافية حتى مثل الأوعية الدموية (كما يتضح من مقدمة السفينة من الأصباغ) تساعد على تحديد نوعية التصوير الكلي (أي التحكم في درجة الحرارة المناسبة ، الحد الأدنى من الصدمة إلى LN، الخ.) 3،6،20. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> الشكل 1. بناء حائز الماوس لLN الماوس التصوير المأبضية أ) الخطط التجمع حامل الماوس؛. ب) إعداد الممثل الماوس intravital ج) حامل الماوس أنجزت الجمعية د) عن قرب وجهات نظر LN المأبضية بعد التعرض الجراحية. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> الشكل 2. تحليل الهجرة من الخلايا اللمفية + GFPفي LN المأبضية. (أ) لقطة 3D مأخوذة من تسلسل التصوير 2P-LSM من LN المأبضية في فأر متلق C57BL / 6 نقل adoptively مع 1x10 7 أيام + GFP 1 اللمفاويات قبل التصوير. خط اندفاعة يدل على الحدود من بصيلات الخلية B، (ب) مسارات هجرة الخلايا اللمفاوية خلال 1 ساعة من التصوير المستمر؛ ج) توزيع إجمالي سرعة هجرة الخلايا اللمفاوية. يعني السرعة = 10.04 ± 4.26 ميكرون / للدقيقة (من مجموع 15125 المسارات تحليلها)؛ د) التفاضل سرعة الهجرة الخلوية توزيع الخلايا الموجودة في جراب الخلية B (الحانات مفتوحة، يعني السرعة = 8.79 ± 3.90 ميكرون / دقيقة، 1525 مجموع تحليل المسارات ) ومنطقة تي خلية (الحانات مغلقة؛ يعني السرعة = 13.77 ± 5.93 ميكرون / دقيقة، ما مجموعه 1250 تحليل المسارات). شريط النطاق = 50 ميكرون. تكميلية الفيديو 1. الوقت الفاصل بين intravital 2P-LSM التصوير على فأرة الحاسوب المأبضية LN كما هو موضح في الشكل رقم 2. تم عزل ما مجموعه من الخلايا الليمفاوية 7 1x10 الابأم متبرع + ubiquitin-GFP الماوس ونقل adoptively عن طريق الوريد إلى الفأر المتلقي C57BL / 6 قبل 24 ساعة من التصوير. وكانت سلسلة من س ص (750 ميكرون × 750 ميكرون) واتخذت صور مضان من خلال مداخن Z ثابت (خطوات ميكرون 5 و 13 خطوات) أن يؤديا إلى كومة التصوير XYZ (750 ميكرون × 750 × 65 ميكرون ميكرون)، والذي كان يتكرر كل 20 ثانية أي ما مجموعه 60 دقيقة، مما أدى إلى تسلسل التصوير xyzt للتحليل السرعة (أرقام 2C، 2D). قراءة السرعة = 450X. شريط النطاق = 50 ميكرون. قضاء الوقت = دقيقة: ثانية. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو تكميلية</a> . تكميلية فيديو 2 تم تكبيره في ضوء تسلسل التصوير في فيديو إضافي 1 في جراب الخلية ب - تي منطقة الحدود الخلية. قراءة السرعة = 450X. شريط النطاق = 25 ميكرون. الطابع الزمني = دقيقة: ثانية <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>لعق هنا لمشاهدة الفيديو التكميلي.

<ol>
	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li><li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity:+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues.">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes.">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen.">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone.">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li><li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo.">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li><li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rulers+over+randomness:+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes.">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li><li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo.">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes.">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8++T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li><li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li><li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells.">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging.">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم أي شيء لكشف.

وقد صاحبت التطورات الحديثة في ذات الدقة العالية في تقنيات التصوير في الموقع، خصوصا 2P-LSM، من خلال الاهتمام المتزايد في دراسة سلوك الخلوية الحيوية في الجسم الحي. تقنية التصوير 4D على LN المأبضية على فأرة الحاسوب حية تسمح مثل هذه التحليلات في السلوك الديناميكي من الخلايا المناعية داخل النسيج undisrupted الصغرى البيئة. استخدام LSM-2P مع كاشفات متعددة تغطي كامل الطيف المرئي يسمح في وقت واحد لجمع البيانات والتصوير من السكان الخلية متعددة. ويمكن الآن يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام الخلايا في الجسم الحي محددة الفئران مراسل فلوري (على سبيل المثال، Ubiquitin eGFP، طلب تقديم العروض، أو eCFP-) جنبا إلى جنب مع الاستفادة من نقل بالتبني من سكان الخلية المسمى تفاضلي باستخدام الأصباغ العضوية خلية فلوري (على سبيل المثال CFSE ، SNARF-1، وخلية المقتفي أورانج) لبحث الآليات الخلوية وظيفة داخل LN. بالإضافة إلى الملاحظة المباشرة للتفاعلات بين ج تتبع تفاضليالسكان الذراع، لا يمكن للبيانات التصوير المتعدد الخضوع لمزيد من التحليل المتاحة تجاريا مع برامج التصوير برامج معالجة (على سبيل المثال Imaris، BitPlane شركة) لتوضيح مزيد من سلوك الخلايا وظيفة. مجموعة واسعة من الاحتمالات موجودة لدراسة آليات التفاعل الخلوية باستخدام هذه في الجسم الحي، وعلى تقنيات السيليكو. القيد الرئيسي من المنهج التجريبي وصفها هنا هو التعقيد التقني الكامنة في نهج عملية جراحية. هذا الأسلوب يتطلب تدريب صارم لتصبح مألوفة مع تشريح ذات الصلة، والإجراءات الدقيقة والمهارات الفنية كما هو مطلوب بموجب هذا البروتوكول. العوامل يزيد من تعقيد وتشمل صعوبة في الحد من تلف الأنسجة أثناء التنقيب LN، وتحسين الاستقرار الأنسجة أثناء التصوير، ومنع الإصابة الحرارية والليزر إلى LN قبل وأثناء تجريب التصوير. واضطراب في أي من هذه العوامل تؤدي إلى أقل من المستوى الأمثل الليمفاويةوالحركة ocyte وبالتالي التدخل مع التفسير الصحيح لتحليل البيانات الناتجة التصوير.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; الكاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; شركة</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج عدد</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurane، جامعة جنوب المحيط الهادئ</td&gt;<td&gt; شركة باكستر للرعاية الصحية</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; نير - شعر محلول إزالة</td&gt;<td&gt; نير</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; برنامج تلفزيوني، 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; تدفئة وسادة</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التدفئة لوحة تحكم</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الهواء وسين<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; درجة الحرارة مسبار</td&gt;<td&gt; هارفارد جهاز</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الملقط دومون # 5</td&gt;<td&gt; العالم أدوات دقيقة، وشركة</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الملقط، غريف ايريس، 7 سم منحني</td&gt;<td&gt; العالم أدوات دقيقة، وشركة</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مقص</td&gt;<td&gt; Roboz أداة جراحية المحدودة، وشركة</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; غطاء من 100x20 ملم صحن زجاج ثقافة الخلية</td&gt;<td&gt; كورنينج</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; غطاء من 100x20 ملم طبق البوليسترين ثقافة الخلية</td&gt;<td&gt; كورنينج</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine الحل (10٪ Povidine-اليود الحل موضعي)</td&gt;<td&gt; بوردو المنتجات، LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

الغدد الليمفاوية (LNS) هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية، والتي تحتل موقعا استراتيجيا في جميع أنحاء الجسم للسماح لمحاصرة وعرض المستضدات الأجنبية من الأنسجة الطرفية لرئيس الوزراء واستجابة جهاز المناعة على التكيف. جنبا إلى جنب بين الاستجابات المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، وLN هو موقع مثالي لدراسة التفاعلات المناعية 1،2 الخلية. الخلايا الليمفاوية (خلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية)، والخلايا الجذعية (DCS)، والضامة تشكل الجزء الأكبر من نخاع العظام المستمدة من العناصر الخلوية من LN. ويحتل موقعا استراتيجيا هذه الخلايا في LN للسماح للمراقبة الفعالة للمستضدات الذات ومستضدات الأجانب المحتملين 3-5. وهذه العملية التي واجهت بنجاح مستضدات الخلايا الليمفاوية وما شابه ذلك هو موضوع تحقيق مكثف في السنوات الأخيرة، وينطوي على تكامل الاتصالات الجزيئي بما في ذلك مستقبلات المستضد، جزيئات الالتصاق، كيموكينات، وهياكل اللحمية مثل شبكة الليفي شبكي 2،6-12 . </p&gt; قبل وضع من فلوري في الوقت الحقيقي وعالية الدقة في التصوير الحي، والمحققين اعتمدوا على التصوير الثابت، الذي لا يقدم سوى الأجوبة المتعلقة التشكل، موقف، والهندسة المعمارية. في حين أن هذه الأسئلة أساسية في فهمنا لسلوك الخلايا المناعية، والقيود الذاتية مع هذه التقنية لا تسمح تحليل للاتجار اللمفاويات فك خيوط والبيئية التي تؤثر على سلوك الخلية الحيوية. في الآونة الأخيرة، وتطوير intravital اثنين من الفوتون سمح ليزر المسح المجهري (2P-LSM) المحققين لعرض حركات ديناميكية وتفاعلات الخلايا الفردية ضمن LNS حية في الموقع 12-16. على وجه الخصوص، وقد طبقت نحن وغيرنا هذا الأسلوب لسلوك صورة الخلوية والتفاعلات داخل LN المأبضية، حيث شكله المدمج، والطبيعة كثيفة توفر ميزة الحصول على بيانات متعددة على مساحة والنسيج واسعة مع الهياكل الفرعية الأنسجة المختلفة 11،17-18 . هذا أنامن المهم أن نلاحظ أن هذه التقنية توفر فوائد إضافية على explanted تقنيات التصوير الأنسجة، والتي تتطلب انقطاع الدم، وتدفق الليمفاوية، وفي نهاية المطاف ديناميات الخلوية للنظام. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة explanted لها نافذة محدودة للغاية من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة للتصوير بعد ازدراع. مع الترطيب المناسب ورصد أحوال الحيوان البيئية، يمكن تمديد الوقت التصوير بشكل ملحوظ مع هذه التقنية intravital. هنا، نقدم طريقة مفصلة لإعداد الماوس المأبضية LN لغرض أداء التصوير intravital.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

وقد مكنت التطورات الحديثة في 2-الفوتون المجهري في الوقت الحقيقي<em&gt; في</em&gt; تصوير الوضع الطبيعي للأنسجة الحية في النماذج الحيوانية، وبالتالي تعزيز قدرتنا على التحقيق في سلوك الخلوية في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نحن الخطوط العريضة الاستعدادات اللازمة لأداء التصوير intravital من العقدة اللمفية المأبضية الماوس.

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K Views.  Case Western Reserve University. وقد مكنت التطورات الحديثة في 2-الفوتون المجهري في الوقت الحقيقي في تصوير الوضع الطبيعي للأنسجة الحية في النماذج الحيوانية، وبالتالي تعزيز قدرتنا على التحقيق في سلوك الخلوية في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نحن الخطوط العريضة الاستعدادات اللا...

Video: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

الفئران عقدة اللمفاوية السطحية جراحة

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن<em&gt; المتصورة</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...