وأيد هذه الدراسة من قبل لجنة التحقيق الوطنية (R01-R01-94160 و155086)، IU مركز السرطان ومركز سيمون ويلز لأبحاث طب الأطفال.

وقد اعتمدت هذه الدراسة من قبل لجنة IACUC في مدرسة جامعة إنديانا للطب. 1. توليد الفئران مع التركيب الوراثي الصحيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء نموذج الفأر من بطاقات عبور الحدود. زميله الفئران K14-CreER (مختبر جاكسون الأوراق المالية رقم 005107) مع R26-SmoM2 الفئران YFP (مختبر جاكسون الأوراق المالية رقم 005130) (18) لتوليد K14-creER + وR26-SmoM2 YFP + الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التنميط الجيني. تزج الذيل العينات (0.5 سم) في directPCR ذيل حل تحلل مع 1 ملغ / مل K بروتين عند درجة حرارة 55 مئوية خلال الليل مع اهتزاز. في اليوم التالي، وإزالة الحطام الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في سرعة قصوى في الدقيقة الطرد المركزي (للحفاظ على لطاف التنميط الجيني). استخدم 1 ميكرولتر من طاف لكل رد فعل PCR مع الاشعال والظروف الموصى بها من قبل البائع. اختر الفئران مع المورثات الحق (في سن من 3-6 أسابيع، بوبرينورفين في 0.05-0.1 سيتم تطبيق ملغم / كغم عن طريق SQ كل 8-12 ساعة لمدة 2-3 أيام بعد قص ذيل) FOR الخطوة 2. </li></ol> 2. لحث على التعبير من SmoM2 من الخلايا الكيراتينية الجلد لحث SmoM2 التعبير في الخلايا القرنية عن طريق الفم من عقار تاموكسيفين (5 ميكروغرام / كغ من وزن الجسم في 50 مل من الزيت النباتي في كل رضاعة) لمدة 5 أيام متتالية من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم مع إبرة التغذية (المنحني قياس 20). 3. إعداد عينات الجلد بشكل عام، الظواهر هي أكثر شدة على الأذن والذيل في K14creER/R26SmoM2 الفئران GFP. للتحضير لتحليل الخلية، ونحن أول حصاد الجلد الماوس بعد التضحية الحيوانية مع إجراء المؤسسية المعتمدة (CO 2 زائد خلع عنق الرحم). 4. عزل البشرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفئران التضحية مع إجراء المعتمدة (راجع الخطوة 3)، وإزالة الفراء باستخدام الانتهازي. عينات الجلد تزج في حل dispase (5 ملغ / مل في DMEM مع FBS 10٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة (1 ساعة بالنسبة للفئران أقل من 8 أسابيع من العمر و 2 ساعةبالنسبة للفئران القديمة من 8 أسابيع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج dispase، البشرة منفصلة عن الأدمة بواسطة ملقط. </li></ol> 5. توليد الخلايا واحد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على السكان خلية واحدة، اللحم المفروم البشرة بواسطة مقص ومن ثم تزج في كولاجيناز الرابع حل (1 ملغ / مل في DMEM مع FBS 10٪) لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في أنبوب مل 50. محاولة دوامة بلطف الأنابيب كل 20 دقيقة للمساعدة تفارق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الخلايا تحت المجهر تفارق. عندما يمكن أن يتم الكشف عن الخلايا واحد في المتوسط ​​كولاجيناز، واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة إضافية لزيادة الغلة الخلية. بشكل عام، يمكن البشرة من الماوس واحد يحقق ما يصل الى 10 7 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد خليط الأنسجة من خلال مصفاة الخلية (حجم المسام 70 ميكرون)، وخلايا تدور باستمرار في 1،500 دورة في الدقيقة عن طريق مقاعد البدلاء أعلى الطرد المركزي، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وقت. </li></ol> 6. خلايا التسمية وإجراء التحليلات التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في FBS 10٪في برنامج تلفزيوني في 2.5 × 10 6 خلية / مل لمنع غير محددة وملزمة (على الجليد لمدة 30 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يأخذ قسامة من الخلايا إلى كل من 1.5 مل microtubes لوضع العلامات الأجسام المضادة المحددة. إضافة الأجسام المضادة المختلفة إلى كل أنبوب في تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل. مزيج الأجسام المضادة مع الخلايا عبر قمة الرأس لطيف لعدة ثوان وتركها على الجليد لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل مع 1 مل PBS. لعينات BCC، استخدمنا الأجسام المضادة للالمؤشرات الحيوية التالية: CD11b-PE زائد GR1-APC (خلايا الدم النخاعي أو خلايا الدم النخاعي القامع المشتقة)؛ vimentin-FITC (الليفية) (انظر الكواشف للحصول على التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلطيخ الخلايا، ونحن نستخدم عدة واتبع دليل للبائع (انظر الكواشف للحصول على التفاصيل). نحن نستخدم خلايا جديدة لتحليل علامات سطح الخلية. بعد تلطيخ علامة السطح، وغسل الخلايا، و resuspend لهم في برنامج تلفزيوني. إضافة دابي إلى خليط الخلية في تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل. سوف دابي وصمة عار الخلايا الميتة التي ستكون خارج بوابات من المزيد من التحليلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات مع specifiالبرمجيات ج. علينا أولا تحديد الخلايا واحد يستند إلى FSC مقابل SSC مؤامرة، واستخدام السكان السلبية دابي (خلايا حية) لمزيد من التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li><li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications.">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li><li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+homolog+of+patched,+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome.">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities.">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li><li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background.">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li><li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis.">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinoma+and+its+development:+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice.">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li><li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patched+1+conditional+null+allele+in+mice.">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li><li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway.">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li><li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model:+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression.">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).</li><li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes.">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وقد وصفت لنا طريقة لتحليل السكان الخلية في بطاقات عبور الحدود. أنسجة الورم متسقة من العديد من أنواع الخلايا، ولكل نوع من الخلايا تتصرف بشكل مختلف في وقت معين من التسرطن، والتي من الصعب جدا لاستعادة حتى في ظل أفضل الظروف في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن أظهرت أن التنمية من سرطان الخلايا القاعدية يرافقه توسع من الخلايا الجذعية البشرة وكذلك تجنيد خلايا الدم النخاعي. بالمقارنة مع المناعية أو مناعي التحليلات، تحليلات السكان الخلية إعطاء تقييم أكثر كمية من التغيرات السكانية الخلية منذ الاجسام المضادة المحددة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا متاحة الآن. لهذا البروتوكول، وهناك حاجة إلى 10 أسابيع لاستكمال الدراسة وذلك لأن التغيير المظهري من تحريض الجينات يتطلب وقتا. وبالتالي فمن المهم أن تخطط التجربة في وقت مبكر. لعزل الخلايا وتحليلات، قد تكون هناك حاجة يومين كله. لأنه يتم استخدام الخلايا الحية لanalysES، فمن المهم أن حجز FACSCalibur في وقت مبكر. لدينا قائمة أيضا المشاكل الشائعة عند العمل مع هذا البروتوكول (انظر أدناه). في تجربتنا، وفيما يلي المشاكل الشائعة التي واجهناها: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفصل الفقراء من البشرة: قد يكون سبب ذلك عن طريق العلاج dispase غير مكتملة (الرجاء زيادة وقت العلاج diapase) أو حل dispase غير كافية (يحتاج الجلد لتكون مغمورة تماما في الحل dispase). نحن نستخدم ما لا يقل عن 5 مل من محلول dispase للماوس واحدة. قد تختلف حجم استنادا إلى حجم من الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العائد المنخفض من عدد الخلايا: هذا قد يرجع إلى الهضم غير مكتملة مع كولاجيناز الرابع. أولا الرجاء تركيز كولاجيناز الاختيار أو تاريخ انتهاء الصلاحية. ويمكن أيضا أن يكون سبب ذلك عن طريق كمية كافية من البشرة المستخدمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يقوم انزيم الهضم في إلى 37 درجة مئوية مع الهز (يرجى ضبط درجة الحرارة قبل إجراء عملية الهضم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتل من الخلايا: هذا أمر شائع جدا لخلايا الجلد (الخلايا ماصةبضع مرات بعد الذهاب من خلال مصفاة (قبل الطرد المركزي)، أو وجود المغنيسيوم 2 + والكالسيوم 2 + في الحل (يرجى استخدام المغنيسيوم 2 + وكا 2 + خالية من برنامج تلفزيوني لغسل الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد كبير جدا من الخلايا الميتة: قد يكون هذا نتيجة لأنسجة المتدهورة (يرجى استخدام الأنسجة الطازجة)، أو الإفراط في الهضم (تجنب الحضانة موسع مع dispase وكولاجيناز الرابع). </li></ol> ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع زرع نخاع العظام أو زرع الأنسجة لدراسة منشأ الخلية. على سبيل المثال، زرع GFP، معربا عن خلايا نخاع العظام في الفئران المعرضة للإشعاع قاتل سوف تسمح لنا للنظر في مساهمة خلايا نخاع العظام إلى الخلايا الليفية الورم المصاحب وخلايا الدم النخاعي. وبالمثل، يمكن زرعها أورام الجلد إلى مجموعة الفأرة الجديدة لدراسة التفاعلات ورم المضيف. بالإضافة إلى دراسة التغيرات السكانية الخلية خلال التسرطن، وسوف يسمح هذا البروتوكول أيضا الباحثين لدراسةآثار العلاجات المخدرات إلى الخلايا في بيئة الورم. على الرغم من أن هذا البروتوكول يهدف إلى استخدام لتحاليل السكان الخلية خلال الجلد التسرطن، تعديلات طفيفة يمكن أن يتم لأنواع السرطان الأخرى. وباختصار، يمكن أن التحليلات السكانية خلية في نماذج الماوس من سرطان الجلد تعطينا التغيرات الديناميكية الخلوية خلال التسرطن، مما يؤدي إلى فهم أفضل لبيولوجيا الخلية في التحول الأورام والأحداث الخلوية المختلفة في عملية التحول.

كما النوع الاكثر شيوعا من سرطان الإنسان، وسرطان الخلايا القاعدية (BCC) يؤثر على حوالي 2 مليون أميركي سنويا 1. تراكم الأدلة تشير إلى أن تفعيل الشاذ من القنفذ (HH) إشارات هي القوة الدافعة وراء تطوير BCC (مراجعة في 2،3). التعديلات سمو يشير في بطاقات عبور الحدود وتشمل الطفرات تعطيل من PTCH1 4-6، والطفرات مكاسب من وظيفة من SMO 7-9، والتعبير المنحرف سمو عوامل النسخ مسار GLI1 10 و 11 GLI2 أو الطفرات المعطل نادرة من السلبية سو منظم (فو ) 12. من خلال كل هذه الدراسات وغيرها، وقد وافق الدواء الاتحادية (FDA) في الآونة الأخيرة استخدام سمو إشارات المانع Vismodegib لعلاج النقيلي المتقدمة محليا وبطاقات عبور الحدود 13-15. على الرغم من كل هذه الإنجازات 16، ونحن ما زلنا لا نفهم الآليات الجزيئية والخلوية التي اتش اتش إشارات يدفع CARCتكون النسيج الليفي. إنشاء نماذج حيوانية باستخدام تنشيط الأنسجة محددة سمو إشارات لا يزال من المهم لهذه الدراسات وعلى فهمنا لمقاومة العقاقير. في الفئران، والفئران البرية من نوع لا تتطور بطاقات عبور الحدود، حتى في ظل جرعات كبيرة من المواد المسببة للسرطان، الأشعة فوق البنفسجية أو المؤينة. في المقابل، Ptch1 + / - الفئران عرضة لتطوير BCC 17،18. وانتفاذ التنمية BCC في Ptch1 + / - الفئران هي أكثر من 50٪ 18،19 على الرغم من Ptch1 + / - الفئران نادرا تطوير بطاقات عبور الحدود مكتملة النمو إذا كان يحتفظ بها في ظل ظروف طبيعية. ويرجع ذلك إلى الفتك الجنينية من Ptch1 - / -، ويستخدم خروج المغلوب الأنسجة محددة من PTCH1 عموما لدراسة 20. وبالإضافة إلى ذلك، مشروط التعبير الجلد محددة من أنكجنيك SmoM2 YFP (Krt14-creER: R26-SmoM2 YFP أو Krt14-جنة المساواة العرقية: R26-SmoM2 YFP) يؤدي إلى تشكيل بطاقات عبور الحدود مجهرية متعددة في سن مبكرة جدا، وتوفير الفحص الجيني سهلة لل إشارات سمو تفعلwnstream من SMO 21. هناك ثلاث قضايا رئيسية في معرفتنا البيولوجيا BCC. الأول، وأصل الخلوية من بطاقات عبور الحدود ليست واضحة تماما. في حين دعم بعض الدراسات تتزحزح من بصيلات الشعر كموقع الخلايا الجذعية 22-24، يوسف وآخرون. 25 مترجمة الخلية الفئران من أصل الجلدية الأورام HH-مدفوعة لتكون في المنطقة البشرة بين مسامي، وليس في بصيلات الشعر ، وذلك باستخدام لجنة المساواة العرقية خلية محددة لتفعيل التعبير من يحركها ROSA26 المعدلة وراثيا متحولة SMO. وثانيا، التفاعلات الخلوية خلال تطوير BCC يست مفهومة جيدا. ومن المعروف أن الخلايا الكيراتينية مع المنشط اتش اتش الإشارات يمكن أن يؤدي إلى تشكيل بطاقات عبور الحدود، ولكن ليست مفهومة جيدا التغيرات الخلوية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن علاج مضادات بيانات التزامات العضوية في الفئران يؤدي إلى مقاومة المخدرات 26-28. نحن بأمس الحاجة إلى أهداف وبالتالي رواية لBCC. فهم هذه القضايا الثلاث يتطلب تحليل التغيرات الخلوية في الفئران خلال carcinogenesis. في حين تم نشر العديد من الأساليب للثقافة الكيراتينية، التدفق الخلوي والجلد الجذعية العزلة الخلية 29-31، وهناك حاليا أي إجراءات شاملة لتحليل الخلية في بطاقات عبور الحدود الماوس. من خلال الجمع بين الأساليب لنموذج الفأر من بطاقات عبور الحدود، والفصل بين البشرة، وتوليد الخلايا واحد من الأنسجة وتحليلات الخلية، وسوف نقدم للقراء مع مجموعة من الإجراءات لدراسة إشارة الخلية الخلوية والتفاعلات الجزيئية أثناء تطوير BCC. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سوف تسمح للقراء لمعرفة كيف يتم إنجاز كل إجراء. وبالإضافة إلى ذلك، قدمنا ​​بعض البيانات لتوضيح ما هي النتائج يجب أن تبدو، ومخرج لمساعدة القراء على التغلب على الصعوبات أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

تطور مرض السرطان هو عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا سرطان السلائف، الخلايا المناعية، الخلايا الليفية والخلايا البطانية. كل نوع من الخلايا يخضع لإشارات وظيفية التغيرات خلال التسرطن. التحدي الحالي لكثير من الباحثين السرطان هو لتشريح هذه التغييرات في كل نوع من الخلايا أثناء عملية متعددة الخطوات في الجسم الحي. في السنوات القليلة الماضية، وضعت الكتاب مجموعة من الإجراءات لعزل السكان خلية مختلفة أثناء تطوير سرطان الجلد باستخدام K14creER/R26-SmoM2 YFP الفئران. وينقسم هذا الإجراء إلى 6 أجزاء: 1) توليد الفئران المناسبة للدراسة (K14creER + وR26-SmoM2 YFP + الفئران في هذا البروتوكول)، 2) حمل SmoM2 YFP التعبير في الجلد الماوس؛ 3) إعداد خزعات الجلد الماوس، 4) عزل البشرة من الجلد؛ 5) إعداد الخلايا واحد من البشرة؛ 6) وصفها السكان خلية واحدة لتحليل التدفق الخلوي.توليد عدد كاف من الفئران مع التركيب الوراثي الصحيح هو الخطوة تحد في هذا البروتوكول، والذي قد يستغرق فترة تصل الى شهرين. بقية الخطوات يستغرق بضع ساعات إلى بضعة أيام. في هذا البروتوكول، ونحن تتضمن أيضا قسم لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. على الرغم من أننا نركز على سرطان الجلد، ويجوز تعديل هذا البروتوكول إلى تقديم طلب للحصول النماذج الحيوانية الأخرى من الأمراض التي تصيب الإنسان.

ومن المعروف أن الفئران لا تتطور سرطان الخلايا القاعدية إلا مع صاحب السمو تفعيل يشير الشكل 1 يبين النمط الظاهري الجلد بعد التعبير الناجم من أنكجنيك مملس، ويظهر SmoM2 YFP. الشكل 2 تحليل خلايا الدم النخاعي في الفئران العادية والحاملة للورم. وتستمد CD11b + + GR1 الخلايا من خلايا الدم النخاعي، وبعضها متعلق بالنخاع الشوكي الخلايا المكثف المشتقة. في الوضع الطبيعي، وCD11b + + GR1 السكان الخلية هو بالكاد يمكن كشفها، ولكن زيادة في استجابة للالتهاب أو ورم التنمية. لقد أظهرنا أن التعبير الناجم عن SmoM2YFP في النتائج الجلد إلى زيادة في CD11b + + GR1 الخلايا. حاليا، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا التغيير في بطاقات عبور الحدود ليست واضحة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> الشكل 1. Morphologicaالتغييرات L بعد الاستقراء SmoM2YFP في الجلد الماوس. أعلى يظهر الرسم البياني من المورثات الماوس. لوحة الأوسط: + K14creER وR26-SmoM2 YFP + الماوس تعامل مع تاموكسيفين أظهرت شذوذ بشكل صارخ في الجلد (يمين) وكذلك أورام الجلد في قسم H &amp; E (يسار). لوحة أسفل: الماوس بدون SmoM2YFP الاستقراء أظهر الجلد يبحث العادية (اليمين) وليس التشكل غير طبيعي في قسم H &amp; E (يسار). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> الشكل 2. تحليل تدفق CD11b + + GR1 الخلايا. دراسة تغيير CD11b + + GR1 الخلايا خلال تطوير سرطان الجلد، ونحن عزل الخلايا واحد والملون مع الأجسام المضادة مضان المسمى لCD11b وGR1. بعد تحليل مع FlowJo، لاحظنا زيادة من هذه الفئة من السكان خلية في أنسجة الجلد من الفئران المعالجة تاموكسيفين.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis at JoVE.com

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

التسرطن هو عملية تنطوي على التفاعل بين الخلايا السرطانية والمكروية السرطان. لتشريح الأحداث الجزيئية، ويحتاج المرء لعزل السكان خلية مختلفة في مراحل مختلفة خلال تطور مرض السرطان. باستخدام نموذج الفأر لسرطان الخلايا القاعدية، ونحن تصف بروتوكول للتحليلات الخلية خلال التسرطن.

تحليلات السكان الخلية خلال الجلد التسرطن

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

cell-population-analyses-during-skin-carcinogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K Views.  Indiana University. التسرطن هو عملية تنطوي على التفاعل بين الخلايا السرطانية والمكروية السرطان. لتشريح الأحداث الجزيئية، ويحتاج المرء لعزل السكان خلية مختلفة في مراحل مختلفة خلال تطور مرض السرطان. باستخدام نموذج الفأر لسرطان الخلايا القاعدية، ونحن تصف بروتوكول للتحليلات الخلية ...

Video: Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

دقيقة وبسيطة قياس الموالية للالتهابات سايتوكاين 1β ايل باستخدام تحفيز الدم الجامعة الفحص

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

كبسولة الكلوي Xenografting وتحت الجلد بيليه الزرع لتقييم البروستات التسرطن وتضخم البروستاتا الحميد

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

المجففة الدم بقعة مجموعة من المؤشرات الحيوية الصحية لتحقيق أقصى قدر من المشاركة في الدراسات السكانية

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

تسلسلي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

الفئران التنظير ل<em&gt; في فيفو</em&gt; شفاء المتعدد الوسائط التصوير من التسرطن وتقييم المعوية والتهاب الجرح

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

نموذج الجلد ماوس الجنين من إصلاح الجرح Scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and unrelieved pressure due to immobility. Animal models have been developed that attempt to mimic these conditions for the purpose of furthering our understanding of the complexity of chronic wounds. The model described herein is a rat ischemic skin flap model that permits a prolonged reduction of blood flow resulting in wounds that become ischemic and resemble a chronic wound phenotype (reduced vascularization, increased inflammation and delayed wound closure). It consists of a bipedicled dorsal flap with 2 ischemic wounds placed centrally and 2 non-ischemic wounds lateral to the flap as controls. A novel addition to this ischemic skin flap model is the placement of a silicone sheet beneath the flap that functions as a barrier and a splint to prevent revascularization and reduce contraction as the wounds heal. Despite the debate of using rats for wound healing studies due to their quite distinct anatomic and physiologic differences compared to humans (i.e., the presence of a panniculus carnosus muscle, short life-span, increased number of hair follicles, and their ability to heal infected wounds) the modifications employed in this model make it a valuable alternative to previously developed ischemic skin flap models.

The rat, due to its size, availability, and rather docile behavior, has been utilized as a research model for many years. The goal of this protocol is to utilize the rat as an ischemic skin wound healing model to provide valuable insight into the pathophysiology of chronic wounds.

مظاهرة في الجرذان الدماغية الجلد الجرح نموذج

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

ميرنا تحليلات التعبير في سرطان البروستاتا الأنسجة السريرية

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

A طريقة المثلثية نمذجة الموسمية التغيير تظاهر مع التصلب المتعدد الانتكاس البيانات

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

الجلدي إزالة التعصيب الجراحي: هناك طريقة لاختبار شرط لالأعصاب في نماذج الماوس من الأمراض الجلدية

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...