يمكن أن يحدد تتبع 3D أحادي الجزيء تعريبات دون الخلايا وسلوكيات الحركة للبروتينات الفردية. إن مراقبة حركة البروتين في خلية حية توفر رؤى مهمة حول تفاعلها مع الشركاء الملزمين في بيئتها الأصلية. توفر الطريقة المعروضة هنا إطارًا عامًا لتحليل بيانات تتبع الجزيء الواحد لحل الحالات الناشرة للجزيئات البيولوجية.
ويمكن تطبيقه على كل من المسارين 2D و 3D التي تقتصر على أحجام الخلايا على شكل تعسفي. بعد إيداع حبة الفلورسنت في وسادة agarose معدة مسبقًا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، ضعه على زلة غلاف المجهر وأضمن زلة الغطاء إلى حامل عينة المجهر. ثم يتم تركيب حامل العينة على مجهر الفلورانس المقلوب.
ثم تهيئة واجهة المستخدم الرسومية من المجهر ؛ هنا ، يتم استخدام البرامج المكتوبة حسب الطلب في MATLAB للتحكم في الصك. تهيئة برنامج الكاميرا HCImage لايف. في علامة التبويب التقاط ضمن قسم التحكم بالكاميرا، قم بتعيين وقت التعرض للضوء إلى 0.03 ثانية، ثم انقر على Live لبدء بث مباشر للكاميرا.
انقر فوق زر الليزر المفتوح المناسب على واجهة GUI لإلغاء حظر الليزر وإثارة الخرز الفلورسنت على لوحة agarose. عرض الانبعاثات الفلورية على الكاميرا باستخدام وضع البث المباشر. ضبط مواضع X و Y لمرحلة المجهر بالنقر فوق أسهم XY-Position تحت قسم مرحلة تحديد المواقع الجزئية لواجهة المستخدم لوضع حبة فلورية واحدة على الأقل في وسط مجال الرؤية.
إذا لزم الأمر، قم بتغيير حجم الخطوة بالنقر على المربع المنسدل أسفل الأسهم. قم بضبط الموضع Z لمرحلة المجهر عن طريق النقر على أسهم Z-Position تحت قسم مرحلة تحديد المواقع النانوني. تعيين اتجاه مزدوج الحلزون نقطة انتشار - وظيفة من حبة الفلورسنت لتكون عمودية.
يتم تعريف هذا الاتجاه العمودي كنقطة بداية في معايرة Z. مسح 30 خطوة فوق وتحت موقف Z بدءا في 50 نانومتر الزيادات. سجل 10 إطارات في كل خطوة باستخدام وقت التعرض 0.03 ثانية.
لبدء عملية الحصول على البيانات التلقائية، انقر على الانتقال تحت Z-معايرة. جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من حرارة صدمت Yersinia enterocolitica الثقافة في 5، 000 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة الثقافة والتخلص من عظمى. غسل بيليه ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام M2G.
بعد الشطف النهائي، resuspend البكتيريا بيليت في 250 ميكرولترات من وسائل الإعلام M2G. يضاف التالي الخرز الفلورسنت لاستخدامها كعلامات فيدوسية. يجب إضافة محلول حبة الفلورسنت بحيث لا يوجد سوى حبات واحدة إلى اثنين لكل مجال من مجالات الرؤية عند عرضها في المجهر.
خلط بلطف التعليق عن طريق دوامة لفصل أي الخلايا المجمعة ولوحة 1.5 ميكرولترات من التعليق على 1.5 إلى 2٪ لوحة agarose مصنوعة من M2G، ثم عكس لوحة ووضعها على زلة غطاء المجهر تنظيف الأوزون. إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف المجهر ووضع حامل العينة على مرحلة المجهر وتأمينه في مكان. تهيئة واجهة المستخدم الرسومية للسيطرة على الكاميرا المجهر ، مرحلة العينة ، وأشعة الليزر الإثارة ثم تهيئة برنامج الكاميرا.
في علامة التبويب التقاط ضمن المقطع "التحكم بالكاميرا"، قم بتعيين وقت التعرض للضوء إلى 0.025 ثانية ثم انقر فوق Live لبدء بث مباشر للكاميرا. ضبط مواقع س و ص من مرحلة المجهر عن طريق النقر فوق الأسهم XY-الموقف تحت قسم مرحلة تحديد المواقع الجزئية لمسح حول العينة والعثور على حقل رؤية مع مجموعة كثيفة بشكل مناسب من الخلايا البكتيرية. لزيادة سرعة نقل البيانات إلى أقصى حد، يجب أن تكون كثافة الخلية على زلة الغطاء أعلى مستوى ممكن دون تداخل الخلايا أو لمس بعضها البعض.
وينبغي أن يشمل مجال الرؤية أيضاً حبة فلورية واحدة على الأقل كعلامة فيدوسية بحيث يمكن قياس التحول في المرحلة أثناء الحصول على البيانات. بعد ذلك ضبط موقف Z من مرحلة المجهر عن طريق النقر على الأسهم Z-موقف تحت قسم مرحلة تحديد المواقع نانو بحيث beadss'double-الحلزون نقطة انتشار وظيفة فصوص هي عمودي. ثم انتقل إلى التسلسل وحدد إعدادات المسح الضوئي.
تغيير عدد عدد مرات الاعتماد على الإطارات إلى 20,000. اختر بعد ذلك مجلد وجهة حفظ بالنقر على الزر المسمى بثلاث نقاط. أخيرا انقر فوق ابدأ لجمع ما يصل إلى 20،000 إطارات الكاميرا باستخدام وقت التعرض قصيرة من 0.025 ثانية.
عند الانتهاء، قم بحظر إضاءة الليزر بالنقر فوق زر إغلاق الليزر المناسب في واجهة المستخدم الرسومية. ثم جمع 200 لقطة من الصور المظلمة باستخدام نفس الوقت التعرض. حدد المربع بجوار Thorlabs LED ثم انقر فوق تبديل مرآة Up.This سوف تتحول على ضوء LED فوق العينة والتبديل المجهر من مسار الفلوريسين إلى مسار النقيض المرحلة.
تهيئة برنامج الحصول على البيانات في مسار النقيض المرحلة واضغط على زر بدء / إيقاف عرض لايف لعرض تغذية حية من الكاميرا. ثم انقر فوق التقاط والذهاب لحفظ الصورة لجمع صورة النقيض من المرحلة من الخلايا في مجال العرض الحالي. تناسب حبة الفلورسنت لاستخدامها كعلامة فيدوسي.
البحث عن كافة التعريبات وكافة إطارات الكاميرا باستخدام عتبات القالب كما هو موضح في بروتوكول النص. ضمن المقطع "محلي DHPSF SM" GUI سهل DHPSF انقر فوق تشغيل لاحتواء إشارات جزيء واحد ثم انقر فوق موافق على الإطارات المنبثقة التالية للحفاظ على الإعدادات الافتراضية. سوف يجد البرنامج إشارات الفلورانس أحادية الجزيء التي تشبه وظيفة انتشار نقطة الحلزون المزدوجة ثم محاولة احتوائها باستخدام نموذج غاوسي مزدوج.
كما يعمل السيناريو، وسوف نرى المستخدم عرض بيانات الصورة الخام، فضلا عن صورة أعيد بناؤها من الإشارات جزيء واحد تركيبها بنجاح. باستخدام البرامج المكتوبة حسب الطلب في MATLAB، ابدأ يدويًا بتحديد خمسة أزواج نقطة تحكم في النافذة المنبثقة عن طريق تقدير أعمدة الخلايا من الخلايا الخمس نفسها والنقر عليها في كل من بيانات تعريب الجزيء الواحد والخطوط العريضة للخلية. حذف الخلايا التي تحتوي على أقل من 10 التعريب وإزالة الخلايا التي يتم وضعها جزئيا خارج مجال العرض، ثم حذف أي خلايا إضافية غير المرغوب فيها في الإطار المنبثقة عن طريق النقر داخل من حدود الخلية الخاصة بهم.
وأخيراً، قم بتعيين التعريبات الموجودة ضمن حدود المخطط التفصيلي للخلية إلى تلك الخلية. تجاهل أي تعريب غير موجود ضمن أي مخطط تفصيلي للخلية. ومن العوامل الحاسمة لنجاح تطبيق هذا البروتوكول ضمان فصل إشارات الجزيء الواحد عن بعضها البعض.
إذا كان هناك أكثر من جزيء الفلوريسينغ في الخلية في نفس الوقت، ثم توطين يمكن أن تسند بشكل غير صحيح إلى مسار جزيء آخر. يعمل هذا البروتوكول على إزالة مشكلة الارتباط عن طريق تجاهل أي مسارات التي يوجد لها تعريبين أو أكثر في نفس الخلية. وهكذا، إذا كانت إشارات الجزيء الواحد كثيفة جداً، يتم تجاهل كمية كبيرة من هذه البيانات تلقائياً أثناء المعالجة.
اعتمادا على مستويات التعبير من البروتينات الانصهار الفلورسنت المسمى، ما يقرب من 200 إلى 3،000 التعريب يمكن أن تنشأ في الخلية الواحدة. يمكن أن تسفر هذه التعريبات عن ما بين 10 إلى 150 مسارًا. وهناك عدد كبير من المسارات اللازمة لإنتاج توزيعات عينات جيدة.
يظهر هنا هو الرسم البياني لمعاملات الانتشار الظاهرة لما يقرب من 80،000 مسار جزيء واحد من Yersinia enterocolitica نوع 3 إفراز البروتين YscQ المسمى مع البروتين الفلوري eYFP. YscQ يرتبط عن طريق الحقن الغشاء جزءا مما أدى إلى جزء من الجزيئات، حوالي 24٪ التي لا تنتشر، كما هو مبين من قبل التوزيع هو مبين في الأسود. الجزيئات YscQ المتبقية تنتشر بحرية في السيتوبول.
خلال الطريقة الموصوفة هنا ، تقرر أن جزيئات YscQ غير المنضمة موجودة في ثلاث حالات منفصلة على الأقل. وتم التوصل إلى هذا الاستنتاج عن طريق تركيب توزيع معاملات الانتشار الظاهرة مع مكتبة من التوزيعات المحاكاة مع معاملات الانتشار المعروفة. عند محاولة حل حالات متعددة من الإنتشار، ينبغي جمع عدة آلاف من مسارات الجزيء الواحد لضمان أخذ عينات جيدة جداً من توزيعات معامل الانتشار الظاهر.
يمكن إجراء تتبع جزيء واحد في خلايا من النوع البري أو في المسوخ الوراثية لتحديد ما إذا كانت الدول الناشرية محددة تظهر فقط عندما يكون شريك الربط الجزيئي موجودًا. من خلال حل الحالات الناشرية للبروتينات السيتوسوليك ومجمعات البروتين باستخدام تتبع 3D أحادي الجزيء ، يمكن للباحثين تحديد أين ومتى وكيف تتشكل مجمعات البروتين القلوية في الخلايا الحية. يمكن أن يكون العمل مع مصادر الليزر عالية الطاقة ومسببات الأمراض البشرية الحية خطرًا للغاية.
وينبغي دائما اتباع البروتوكولات المناسبة للسلامة بالليزر والسلامة البيولوجية.
