3D одномекулярное отслеживание может определить субклеточную локализацию и поведение движения отдельных белков. Наблюдение за движением белка в живой клетке дает важные сведения о его взаимодействии с связывающими партнерами в его родной среде. Представленный здесь метод обеспечивает общую основу для анализа данных слежения за одной молекулой для разрешения диффузных состояний биологических молекул.
Он может быть применен как к 2D, так и к 3D траекториям, которые ограничиваются произвольно сформированными объемами клеток. После депонирования флуоресцентного шарика в заранее подготовленной агарозной площадке, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, поместите его на квитанцию крышки микроскопа и закрепите крышку скольжения к держателю образца микроскопа. Затем держатель образца устанавливается на перевернутый флуоресцентный микроскоп.
Затем инициализируйте графический пользовательский интерфейс микроскопа; здесь для управления инструментами используется специально написанное программное обеспечение в MATLAB. Инициализировать программное обеспечение камеры HCImage Live. Во вкладке Захват под разделом Управления камерой установите время экспозиции до 0,03 секунды, а затем нажмите Live, чтобы начать прямую трансляцию камеры.
Нажмите соответствующую кнопку Open Laser на интерфейсе GUI, чтобы разблокировать лазер и возбудить флуоресцентные бусы на агарозной площадке. Просмотр флуоресценции излучения на камеру с помощью режима живого потока. Отрегулируйте положения X и Y стадии микроскопа, нажав стрелки XY-позиции под разделом Micro-Positioning Stage пользовательского интерфейса, чтобы распоидать по крайней мере одну флуоресцентную шарик в центре поля зрения.
При необходимости измените размер шага, нажав на поле падения ниже стрелок. Далее отрегулируйте положение на этапе микроскопа, нажав на стрелки позиции под разделом Nano-Positioning Stage. Установите ориентацию двойной спирали точки распространения функции флуоресцентного шарика, чтобы быть вертикальной.
Эта вертикальная ориентация определяется как отправная точка калибровки. Сканирование 30 шагов выше и ниже стартовой позиции в 50 нанометров шагом. Запись 10 кадров на каждом шагу с использованием времени экспозиции 0,03 секунды.
Чтобы начать автоматическое получение данных, нажмите на кнопку Перейти под калибровку. Центрифуга один миллилитр теплового шока Yersinia enterocolitica культуры в 5000 раз тяжести в течение трех минут при комнатной температуре затем удалить культуру и отказаться от супернатанта. Вымойте гранулы три раза с одним миллилитров M2G средств массовой информации.
После окончательного полоскания, повторно гранулы бактерий в 250 микролитров M2G средств массовой информации. Далее добавить флуоресцентные бусы для использования в качестве фидуциальных маркеров. Флуоресцентный шарик решение должно быть добавлено так, что Есть только один-два бусинки на поле зрения при просмотре в микроскоп.
Аккуратно смешайте подвеску вихрем, чтобы отделить любые агрегированные клетки и пластины 1,5 микролитров подвески на 1,5 до 2%agarose площадку, сделанную с M2G, а затем инвертировать площадку и поместить его на озоно-очищенный микроскоп крышка скольжения. Добавьте каплю масла погружения на цель микроскопа и поместите держатель образца на стадию микроскопа и закрепляйте его на месте. Инициализируйте графический пользовательский интерфейс для управления камерой микроскопа, этапом образца и лазерами возбуждения, а затем инициализируйте программное обеспечение камеры.
Во вкладке Захват под разделом Управления камерой установите время экспозиции до 0,025 секунды, а затем нажмите Live, чтобы начать прямую трансляцию камеры. Отрегулируйте положения X и Y стадии микроскопа, нажав стрелки XY-позиции под разделом Micro-Positioning Stage, чтобы сканировать вокруг образца и найти поле зрения с соответствующей плотной популяцией бактериальных клеток. Чтобы максимизировать пропускную способность данных, плотность ячеек на крышке должна быть как можно выше без перекрытия или прикосновения клеток друг к другу.
Поле зрения должно также включать по крайней мере один флуоресцентный шарик в качестве фидуциального маркера, с тем чтобы сдвиг стадии можно было измерить при сборе данных. Затем отрегулируйте положение в стадии микроскопа, нажав на стрелки позиции под разделом Nano-Positioning Stage, чтобы флуоресцентные бусины'double-helix point-spread-function доли были вертикальными. Затем перейдите к последовательности и выберите Настройки сканирования.
Измените количество кадров до 20 000. Затем выберите папку сохранения назначения, нажав на кнопку, помеченную тремя точками. Наконец нажмите Кнопку Начать собирать до 20 000 кадров камеры, используя короткое время экспозиции 0,025 секунды.
После завершения, блокировать лазерное освещение, нажав соответствующую кнопку Close Laser в графическом пользовательском интерфейсе. Затем соберите 200 кадров темных изображений, используя то же время экспозиции. Проверьте поле рядом со светодиодом Thorlabs, а затем нажмите Toggle Mirror Up.This включит светодиодный свет над образцом и переключит микроскоп с пути флуоресценции на фазовую контрастную дорожку.
Инициализируйте программное обеспечение для сбора данных на пути контрастности фазы и нажмите кнопку Start/Stop Live Display, чтобы просмотреть прямую трансляцию с камеры. Затем нажмите Capture and Go, чтобы сохранить изображение, чтобы собрать фазовое контрастное изображение ячеек в текущем поле зрения. Fit флуоресцентный шарик для использования в качестве фидуциального маркера.
Найти и поместить все локализации и все кадры камеры, используя пороговые значения шаблона, описанные в текстовом протоколе. В разделе Локализация DHPSF SM gui Easy-DHPSF нажмите Run, чтобы соответствовать одномекулярными сигналами, а затем нажмите OK на следующие всплывающие окна, чтобы сохранить настройки по умолчанию. Программное обеспечение найдет одномекулярные сигналы флуоресценции, которые напоминают двойную спираль точки распространения функции, а затем попытаться соответствовать им с помощью двойной гауссийской модели.
При запуске скрипта пользователь увидит отображение необработанных данных изображения, а также реконструированное изображение успешно установленных одномекулярных сигналов. Используя специально написанное программное обеспечение в MATLAB, начните с ручного выбора пяти пар контрольных токов во всплывающем окне, приблизительно оценивая и нажимая на клеточные столбы тех же пяти ячеек как в одномерных данных локализации, так и в контурах клеток. Удалить ячейки, содержащие менее 10 локализаций, и удалить ячейки, которые расположены частично вне поля зрения, а затем удалить любые дополнительные нежелательные ячейки во всплывающем окне, нажав внутри их контур ячейки.
Наконец, назначьте локализации, на которых находится граница контура ячейки, этой ячейке. Откажитесь от любых локализаций, не расположенных в пределах контура ячейки. Важнейшим фактором успешного применения этого протокола является обеспечение того, чтобы одномекулярные сигналы хорошо отделялись друг от друга.
Если в клетке одновременно находится более одной флуоресцентной молекулы, то локализация может быть неправильно назначена на траекторию другой молекулы. Этот протокол работает, чтобы устранить проблему увязки, отбрасывая любые траектории, для которых две или более локализаций одновременно присутствуют в одной ячейке. Таким образом, если одномекулярные сигналы слишком плотны, большое количество этих данных автоматически отбрасывается во время обработки.
В зависимости от уровня экспрессии флуоресцентно помеченных белков синтеза, на клетку может быть сгенерировано от 200 до 3000 локализаций. Эти локализации могут дать от 10 до 150 траекторий. Для получения хорошо отобранных распределений необходимо большое количество траекторий.
Здесь показана гистограмма видимых диффузионных коэффициентов для почти 80 000 одномолекулярных траекторий энтероколитика типа 3 секреции белка Ysc' помечена флуоресцентным белком eYFP. Иске связывается с мембранными инжезомами, что приводит к фракции молекул, около 24%, которые не рассеиваются, о чем свидетельствует распределение, показанные черным. Оставшиеся молекулы Ysc' свободно рассеиваются в цитозоле.
В ходе метода, описанного здесь, установлено, что неопределимые молекулы Ysc, по крайней мере, в трех различных диффузных состояниях. Этот вывод был сделан путем установки распределения очевидных диффузионных коэффициентов с библиотекой смоделированных дистрибутивных распределений с известными диффузионные коэффициенты. При попытке разрешить множественные диффузивные состояния необходимо собрать несколько тысяч одномекулярных траекторий, чтобы обеспечить очень хорошую выборку видимых диффузионных коэффициентов.
Одномекулярное отслеживание может быть выполнено в клетках дикого типа или в генетических мутантах удаления, чтобы определить, проявляются ли конкретные диффузные состояния только тогда, когда присутствует молекулярный связующий партнер. Решая диффузные состояния цитозоловых белков и белковых комплексов с помощью 3D-одномекулярного слежения, исследователи могут определить, где, когда и как в живых клетках образуются олигомерные белковые комплексы. Работа с высокоскоростных лазерных источников и живых патогенов человека может быть чрезвычайно опасным.
Всегда должны соблюдаться соответствующие протоколы лазерной безопасности и биобезопасности.
