3D 단일 분자 추적은 개별 단백질의 세포전 국소화 및 동작 거동을 결정할 수 있다. 살아있는 세포에서 단백질의 움직임을 관찰하면 네이티브 환경에서 결합 파트너와의 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 생물학 분자의 확산 상태를 해결하기 위하여 단 하나 분자 추적 데이터를 분석하기 위한 일반적인 틀을 제공합니다.
임의로 형성된 세포 체적에 국한된 2D 및 3D 궤적 모두에 적용될 수 있다. 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 미리 준비된 아가로즈 패드에 형광 비드를 증착한 후 현미경 커버 슬립에 놓고 현미경 샘플 홀더에 커버 슬립을 고정시하십시오. 샘플 홀더는 반전형 형광 현미경에 장착됩니다.
그런 다음 현미경의 그래픽 사용자 인터페이스를 초기화합니다.여기에서 MATLAB의 사용자 지정 소프트웨어는 계측기 제어에 사용됩니다. 카메라 소프트웨어 HCImage 라이브를 초기화합니다. 카메라 컨트롤 섹션 아래의 캡처 탭에서 노출 시간을 0.03초로 설정한 다음 Live를 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 시작합니다.
GUI 인터페이스의 적절한 레이저 열기 버튼을 클릭하여 레이저의 차단을 해제하고 아가로즈 패드의 형광 구슬을 흥분시킵니다. 라이브 스트림 모드를 사용하여 카메라의 형광 방출을 봅니다. 사용자 인터페이스의 마이크로 포지셔닝 스테이지 섹션에서 XY 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 X 및 Y 위치를 조정하여 시야의 중심에 적어도 하나의 형광 비드를 배치합니다.
필요한 경우 화살표 아래의 드롭다운 상자를 클릭하여 단계 크기를 변경합니다. 다음으로 나노 포지셔닝 스테이지 섹션 아래의 Z 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 Z 위치를 조정합니다. 형광 비드의 이중 나선 점 확산 기능의 방향을 수직으로 설정합니다.
이 수직 방향은 Z 교정의 시작점으로 정의됩니다. 50나노미터 단위로 시작 Z 위치 위와 아래 30단계를 스캔합니다. 노출 시간 0.03초를 사용하여 각 단계에서 10프레임을 기록합니다.
자동화된 데이터 수집을 시작하려면 Z-교정 에서 이동을 클릭합니다. 원심분리기 는 실온에서 3 분 동안 5, 000 배 중력에서 열 충격 예르시니아 장골염 배양의 1 밀리리터 다음 문화를 제거하고 상체를 폐기합니다. M2G 미디어의 1 밀리리터로 펠릿을 세 번 씻으십시오.
최종 헹구기 후, M2G 매체의 250 마이크로 리터에서 펠렛 박테리아를 다시 중단하십시오. 다음으로 형광 구슬을 추가하여 서적 마커로 사용할 수 있습니다. 형광 비드 용액은 현미경에서 볼 때 시야당 1 ~2 개의 구슬만 있도록 추가해야합니다.
어떤 응집된 세포와 플레이트 1.5 마이크로리터를 M2G로 만든 1.5~2% 아가로즈 패드에 분리한 다음 패드를 반전시키고 오존 세척 현미경 커버 슬립에 놓음으로써 서스펜션을 부드럽게 혼합합니다. 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 추가하고 현미경 단계에 샘플 홀더를 배치하고 제자리에 고정합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 초기화하여 현미경의 카메라, 샘플 스테이지 및 흥분 레이저를 제어한 다음 카메라 소프트웨어를 초기화합니다.
카메라 제어 섹션 아래의 캡처 탭에서 노출 시간을 0.025초로 설정한 다음 Live를 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 시작합니다. 마이크로 포지셔닝 스테이지 섹션 아래의 XY 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 X 및 Y 위치를 조정하여 시료 를 스캔하고 세균 세포의 적절한 밀도가 높은 인구로 시야를 찾습니다. 데이터 처리량을 최대화하려면 세포가 서로 겹치거나 닿지 않으면 커버 슬립의 세포 밀도가 가능한 한 높아야 합니다.
시야는 또한 데이터를 획득하는 동안 단계 시프트를 측정할 수 있도록 적어도 하나의 형광 비드를 fiducial 마커로 포함시켜야 합니다. 다음으로 나노 포지셔닝 단계 섹션 아래의 Z 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 Z 위치를 조정하여 형광 구슬의 이중 나선 점 확산 기능 로브가 수직입니다. 그런 다음 시퀀스로 이동하여 스캔 설정을 선택합니다.
프레임 수를 20, 000으로 변경합니다. 다음으로 세 개의 점으로 표시된 단추를 클릭하여 저장 대상 폴더를 선택합니다. 마지막으로 시작하려면 0.025초의 짧은 노출 시간을 사용하여 최대 20, 000 카메라 프레임을 수집합니다.
완료되면 그래픽 사용자 인터페이스에서 적절한 레이저 닫기 버튼을 클릭하여 레이저 조명을 차단합니다. 그런 다음 동일한 노출 시간을 사용하여 200 프레임의 어두운 이미지를 수집합니다. Thorlabs LED 옆에 있는 상자를 확인한 다음 Toggle Mirror Up.This는 시편 위의 LED 조명을 켜고 형광 경로에서 위상 대비 경로로 현미경을 전환합니다.
위상 대비 경로에서 데이터 수집 소프트웨어를 초기화하고 시작/중지 라이브 디스플레이 버튼을 눌러 카메라에서 라이브 피드를 볼 수 있습니다. 그런 다음 캡처를 클릭하고 이동하여 이미지를 저장하여 현재 시야에서 셀의 위상 대비 이미지를 수집합니다. 형광 비드에 맞게 서적 마커로 사용하십시오.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 템플릿 임계값을 사용하여 모든 지역화 및 모든 카메라 프레임을 찾고 맞춥시게 합니다. Easy-DHPSF GUI의 DHPSF SM 섹션의 로컬화 에서 실행을 클릭하여 단일 분자 신호에 맞게 한 다음 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다. 이 소프트웨어는 이중 나선 점 확산 기능을 닮은 단일 분자 형광 신호를 찾아 서 이중 가우시안 모델을 사용하여 착용하려고 시도합니다.
스크립트가 실행되면 사용자는 원시 이미지 데이터의 표시와 성공적으로 장착된 단일 분자 신호의 재구성된 이미지를 볼 수 있습니다. MATLAB에서 사용자 지정 작성된 소프트웨어를 사용하여 단일 분자 지역화 데이터 및 셀 윤곽선 모두에서 동일한 5개의 셀의 셀 폴을 대략적으로 추정하고 클릭하여 팝업 창에서 5개의 제어점 쌍을 수동으로 선택하여 시작합니다. 10개 미만의 지역화가 포함된 셀을 삭제하고 시야 외부에 부분적으로 배치된 셀을 제거한 다음 셀 윤곽선 내부를 클릭하여 팝업 창에서 원치 않는 추가 셀을 삭제합니다.
마지막으로 셀 의 윤곽선 경계 내에 있는 지역화를 해당 셀에 할당합니다. 셀 윤곽선 내에 없는 지역화를 폐기합니다. 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 중요한 요소는 단일 분자 신호가 서로 잘 분리되는지 확인하는 것입니다.
동시에 세포에 하나 이상의 형광 분자가 있는 경우에, 그 때 현지화는 다른 분자의 궤적에 잘못 할당될 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 개 이상의 지역화가 동일한 셀에 동시에 존재하는 모든 궤적을 폐기하여 연결 문제를 제거하는 데 작동합니다. 따라서 단일 분자 신호가 너무 조밀한 경우 처리 중에 많은 양의 데이터가 자동으로 폐기됩니다.
형광 표지 융합 단백질의 발현 수준에 따라, 세포당 약 200 ~ 3, 000국산화가 생성될 수 있다. 이러한 지역화는 10에서 150개의 궤적을 생성할 수 있습니다. 잘 샘플링된 분포를 생성하려면 많은 수의 궤적이 필요합니다.
여기에 나타난 것은 형광 단백질 eYFP로 표지된 YscQ 의 80, 000의 단일 분자 궤적에 가까운 명백한 확산 계수의 히스토그램이다. YscQ는 막 에 박힌 주입에 결합하여 분자의 분수의 결과로, 검은 색으로 표시된 분포에 의해 표시된 바와 같이 확산되지 않는 약 24 %. 나머지 YscQ 분자는 사이토솔에서 자유롭게 확산됩니다.
여기서 설명된 방법 동안, 언바운드 YscQ 분자가 적어도 3개의 뚜렷한 확산 상태에 존재한다는 것을 결정된다. 이러한 결론은 명백한 확산 계수의 분포를 알려진 확산 계수와 함께 시뮬레이션된 분포 라이브러리와 피팅하여 이루어졌습니다. 다중 확산 상태를 해결하려고 할 때, 수천 개의 단일 분자 궤적을 수집하여 명백한 확산 계수 분포가 매우 잘 샘플링되도록 해야 합니다.
단일 분자 추적은 야생 형 세포 또는 유전 삭제 돌연변이에서 수행될 수 있어 분자 결합 파트너가 존재하는 경우에만 특정 확산 상태가 나타나는지 여부를 결정할 수 있습니다. 3D 단일 분자 추적을 사용하여 세포단백질과 단백질 복합체의 확산 상태를 해결함으로써 연구자들은 살아있는 세포에서 올리고메릭 단백질 복합체가 어디에서, 언제, 어떻게 형성되는지를 결정할 수 있습니다. 고전력 레이저 소스와 살아있는 인간 병원체와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있습니다.
적절한 레이저 안전 및 생물 안전 프로토콜은 항상 따라야 합니다.
