El seguimiento 3D de una sola molécula puede determinar las localizaciones subcelulares y los comportamientos de movimiento de las proteínas individuales. Observar el movimiento de una proteína en una célula viva proporciona información importante sobre su interacción con socios de unión en su entorno nativo. El método presentado aquí proporciona un marco general para analizar datos de seguimiento de una sola molécula para resolver los estados difusores de moléculas biológicas.
Se puede aplicar a trayectorias 2D y 3D que se limitan a volúmenes de celdas con forma arbitraria. Después de depositar un cordón fluorescente en una almohadilla de agarosa pre-preparada como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña, colóquelo en un resbalón de la cubierta del microscopio y asegure el resbalón de la cubierta al soporte de la muestra del microscopio. El portacuchillas se monta en un microscopio de fluorescencia invertido.
A continuación, inicializar la interfaz gráfica de usuario del microscopio;aquí, el software escrito a medida en MATLAB se utiliza para el control de instrumentos. Inicializar el software de cámara HCImage Live. En la pestaña Captura de la sección Control de cámara, establezca el tiempo de exposición en 0,03 segundos y, a continuación, haga clic en Live (En directo) para iniciar una transmisión en directo de la cámara.
Haga clic en el botón Abrir láser apropiado en la interfaz GUI para desbloquear el láser y excitar las perlas fluorescentes en la almohadilla de agarosa. Vea la emisión de fluorescencia en la cámara utilizando el modo de transmisión en vivo. Ajuste las posiciones X e Y de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas Posición XY debajo de la sección Etapa de microposición de la interfaz de usuario para colocar al menos un cordón fluorescente en el centro del campo de visión.
Si es necesario, modifique el tamaño del paso haciendo clic en el cuadro desplegable debajo de las flechas. A continuación, ajuste la posición Z de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas de posición Z debajo de la sección Etapa de nanoposición. Establezca la orientación de la función de dispersión de punto de doble hélice del cordón fluorescente para que sea vertical.
Esta orientación vertical se define como el punto de partida en la calibración Z. Escanee 30 pasos por encima y por debajo de la posición Z inicial en incrementos de 50 nanómetros. Registre 10 fotogramas en cada paso utilizando un tiempo de exposición de 0,03 segundos.
Para iniciar la adquisición automatizada de datos, haga clic en Ir en Z-Calibración. Centrifugar un mililitro de cultivo de Yersinia enterocolitica con choque térmico a 5.000 veces la gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente y luego retire el cultivo y deseche el sobrenadante. Lave el pellet tres veces con un mililitro de medios M2G.
Después del enjuague final, resuspender las bacterias peletizadoras en 250 microlitros de medios M2G. A continuación, agregue perlas fluorescentes para utilizar como marcadores fiduciarios. La solución de perlas fluorescentes debe añadirse para que solo haya de una a dos cuentas por campo de visión cuando se vea en el microscopio.
Mezclar suavemente la suspensión por vórtices para separar las células agregadas y la placa 1,5 microlitros de la suspensión en una almohadilla de agarosa de 1,5 a 2% hecha con M2G, luego invierta la almohadilla y colóquela en un resbalón de cubierta de microscopio limpiado con ozono. Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio y coloque el soporte de muestra en la etapa del microscopio y fíjelo en su lugar. Inicialice la interfaz gráfica de usuario para controlar la cámara, la etapa de muestreo y los láseres de excitación del microscopio y, a continuación, inicialice el software de la cámara.
En la pestaña Captura de la sección Control de cámara, establezca el tiempo de exposición en 0,025 segundos y, a continuación, haga clic en Live (Live) para iniciar una transmisión en directo de la cámara. Ajuste las posiciones X e Y de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas posición XY debajo de la sección Etapa de microposición para escanear alrededor de la muestra y encontrar un campo de visión con una población adecuadamente densa de células bacterianas. Para maximizar el rendimiento de los datos, la densidad de celdas en el resbalón de cubierta debe ser lo más alta posible sin que las celdas se superpongan o se toquen entre sí.
El campo de visión también debe incluir al menos un cordón fluorescente como marcador fiduciario para que el desplazamiento de etapa se pueda medir mientras se adquieren los datos. A continuación, ajuste la posición Z de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas de posición Z debajo de la sección Etapa de nanoposición para que los lóbulos de doble función de dispersión de punto de doble hélice de las cuentas fluorescentes sean verticales. A continuación, vaya a Secuencia y seleccione Configuración de escaneado.
Cambie el número de recuentos de fotogramas a 20.000. A continuación, elija una carpeta de destino de guardado haciendo clic en el botón etiquetado con tres puntos. Por último, haga clic en Iniciar para recopilar hasta 20.000 fotogramas de cámara con un tiempo de exposición corto de 0,025 segundos.
Cuando haya terminado, bloquee la iluminación láser haciendo clic en el botón Cerrar láser apropiado en la interfaz gráfica de usuario. A continuación, recopile 200 fotogramas de imágenes oscuras utilizando el mismo tiempo de exposición. Marque la casilla junto a Thorlabs LED y luego haga clic Toggle Mirror Up.This encenderá la luz LED por encima de la muestra y cambiará el microscopio de la vía de fluorescencia a la vía de contraste de fase.
Inicialice el software de adquisición de datos en la vía de contraste de fase y pulse el botón Start/Stop Live Display para ver una transmisión en directo desde la cámara. A continuación, haga clic en Capturar e ir para guardar la imagen para recopilar una imagen de contraste de fase de las celdas en el campo de visión actual. Ajuste el cordón fluorescente para su uso como marcador fiduciario.
Busque y ajuste todas las localizaciones y todos los marcos de la cámara utilizando los umbrales de plantilla como se describe en el protocolo de texto. En la sección Localizar DHPSF SM de la GUI Easy-DHPSF, haga clic en Ejecutar para ajustarse a las señales de una sola molécula y, a continuación, haga clic en Aceptar en las siguientes ventanas emergentes para mantener la configuración predeterminada. El software encontrará señales de fluorescencia de una sola molécula que se asemejan a la función de dispersión de punto de doble hélice y luego intentan encajarlas utilizando un modelo de doble gaussiano.
A medida que se ejecuta el script, el usuario verá una visualización de los datos de imagen sin procesar, así como una imagen reconstruida de las señales de una sola molécula ajustadas con éxito. Usando software escrito a medida en MATLAB, comience seleccionando manualmente cinco pares de puntos de control en la ventana emergente estimando y haciendo clic aproximadamente en los polos de celda de las mismas cinco celdas tanto en los datos de localización de una sola molécula como en los contornos de celda. Elimine las celdas que contienen menos de 10 localizaciones y elimine las celdas que se colocan parcialmente fuera del campo de visión y, a continuación, elimine las celdas no deseadas adicionales en la ventana emergente haciendo clic dentro del contorno de su celda.
Por último, asigne localizaciones que residan dentro del límite del contorno de una celda a esa celda. Deseche las localizaciones que no se encuentren dentro de ningún esquema de celda. Un factor crítico para la aplicación exitosa de este protocolo es asegurar que las señales de una sola molécula estén bien separadas entre sí.
Si hay más de una molécula fluorescente en una célula al mismo tiempo, entonces la localización se puede asignar incorrectamente a la trayectoria de otra molécula. Este protocolo funciona para eliminar el problema de vinculación descartando cualquier trayectoria para la que dos o más localizaciones estén presentes simultáneamente en la misma celda. Por lo tanto, si las señales de una sola molécula son demasiado densas, una gran cantidad de estos datos se descartan automáticamente durante el procesamiento.
Dependiendo de los niveles de expresión de las proteínas de fusión con etiqueta fluorescente, se pueden generar aproximadamente 200 a 3.000 localizaciones por célula. Estas localizaciones pueden producir entre 10 y 150 trayectorias. Un gran número de trayectorias son necesarias para producir distribuciones bien muestreadas.
Aquí se muestra el histograma de coeficientes de difusión aparentes para cerca de 80.000 trayectorias de una sola molécula de la proteína de secreción Yersinia enterocolitica Tipo 3 YscQ etiquetada con proteína fluorescente eYFP. YscQ se une a los inyectables incrustados en membrana dando como resultado una fracción de moléculas, alrededor del 24% que no se difunden, como lo indica la distribución mostrada en negro. Las moléculas YscQ restantes se difunden libremente en el citosol.
Durante el método descrito aquí, se determina que las moléculas YscQ no enlazadas existen en al menos tres estados difusores distintos. Esta conclusión se llegó ajustando la distribución de coeficientes de difusión aparentes con una biblioteca de distribuciones simuladas con coeficientes de difusión conocidos. Al intentar resolver múltiples estados difusores, se deben recolectar varios miles de trayectorias de una sola molécula para garantizar que las distribuciones del coeficiente de difusión aparente se muestreen muy bien.
El seguimiento de una sola molécula se puede realizar en células de tipo salvaje o en mutantes de eliminación genética para determinar si los estados difusos específicos se manifiestan solo cuando hay un socio de unión molecular. Al resolver los estados difusores de las proteínas citosólicas y los complejos proteicos utilizando el seguimiento 3D de una sola molécula, los investigadores pueden determinar dónde, cuándo y cómo se forman los complejos de proteínas oligoméricas en las células vivas. Trabajar con fuentes láser de alta potencia y patógenos humanos vivos puede ser extremadamente peligroso.
Siempre se deben seguir los protocolos adecuados de seguridad láser y bioseguridad.
