Этот протокол показывает, что можно генерировать новые нейроны непосредственно в мозге от резидентов глии, и что эти перепрограммированные клетки созревают в подтип-специфических нейронов. Основным преимуществом является кре-зависимый вирус AAV, который позволяет конкретные ориентации NG2-глии и GFP репортер, который маркирует перепрограммированных нейронов для анализа. Создание новых нейронов в головном мозге может привести к будущему развитию клеточной заместительной терапии в головном мозге.
В нашем протоколе мы генерируем парвалбумин-положительные интернейроны, которые имеют последствия для психических расстройств. В vivo перепрограммирование может быть применено к другим областям мозга и схем в зависимости от того, что нейрональный фенотип и неврологическое состояние вы хотите целевой. Демонстрация процедуры будет Дженни Johansson: техник, Мария Перейра: бывший аспирант, и Марселла Birtele: аспирант в нашей лаборатории.
Для производства вирусного вектора AAV5 семенные клетки HEK293T со стандартной культурной средой в пяти колбы T175. Когда клетки достигнут 50 до 70% слияния, подготовить следующую смесь для трансвекции. В 50 миллилитровую центрифугу, добавить равное количество моляра векторной плазмиды, и PDG серии помощник плазмид.
Добавьте буфер Tris-EDTA к окончательному объему 144 микролитров, затем добавьте ультрачистую воду, чтобы привести к общей громкости 1296 микролитров и смеси. Затем добавьте 144 микролитров 2,5 хлорида молярного кальция и перемешайте. После этого добавьте 1,92 миллилитров HBS в раствор ДНК и вихрь немедленно.
Инкубировать при комнатной температуре ровно 60 секунд. Впоследствии перенесите раствор на 28 миллилитров свежеклеточной культуры среды и перемешайте. Замените среду в колбе средой, содержащей трансвекционную смесь.
Подождите три дня, и передать средства массовой информации в отходы. Добавьте пять миллилитров буфера сбора урожая в каждую колбу, затем добавьте еще четыре миллилитров DPBS в каждую колбу, чтобы промыть оставшиеся ячейки и объединить с клеточным раствором. Центрифуга собранных клеток на 1000 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
После центрифугации снимите супернатант и растворите гранулы в 15 миллилитров буфера лиза. Заморозить 50 миллилитровую центрифугу трубку на сухом льду в течение 15 минут и хранить в морозильной камере минус 20 градусов по Цельсию. Перед употреблением оттаивать собранную клетку лизировать в водяной бане при 37 градусах по Цельсию.
В этой процедуре, выполнить AAV очистки йодиксанол градиент ультрацентрифугации и использовать ультрацентрифуг потолочные трубки с центрифугой на 350000 х г в течение одного часа и 45 минут при комнатной температуре. Чтобы извлечь AAV содержащие фазы, вставьте 10 миллилитров шприц с 18 калибровочных иглы примерно на два миллиметра ниже 40 до 60% фазы границы с скошенной лицом вверх и уйти. Убедитесь в том, чтобы остановить до достижения белковой полосы после пяти до шести миллилитров вирусного вектора была извлечена.
Затем очистите и сконцентрирует разбавленный градиент йодиксанола через фильтр обмена аниона, проталкивая его со скоростью не быстрее одной капли в секунду. Впоследствии, нажмите три миллилитров буфера IE медленно через фильтр, чтобы вымыть его. Далее, elute смесь в центробежный блок фильтра с одним-двумя миллилитров элюционного буфера.
Добавьте DPBS к устройству до конечного объема в четыре миллилитров. Центрифуга при температуре 2 000 х г при комнатной температуре до менее 0,5 миллилитров DPBS остается в фильтре. После этого снимите жидкость со дна трубки, заправь четырьмя миллилитров DPBS и снова центрифугу.
Повторите этот шаг еще два раза, убедитесь, что объем концентрированного вектора на фильтре составляет около 200 микролитров после последней центрифугации. Удалите 200 микролитер концентрированный вектор с помощью пипетки, и протолкнуть его через фильтр 0,22 микрометра для стерилизации. Далее, aliquot 200 микролитров в стеклянный флакон с переплетенной вставкой.
Чтобы ввести факторы перепрограммирования, поместите анестезированной мыши в стереотаксис кадра. Администрирование соответствующих анальгезии в начале операции, а затем принести кончик стеклянной капиллярной инъекционной иглы чуть выше брегмы. Убедитесь, что кончик капилляров идеально прямо в обоих A-P и M-L плоскостей.
Сбросить значения M-L и A-P до 0,0 на счетчике цифровых координат. Чтобы убедиться, что голова животного находится в совершенно плоском положении, используйте счетчик цифровых координат для измерения значения координат D-V, когда рука A-P находится на плюс 2,0 и минус 2,0, а также когда рука M-L находится на плюс 2,0 и минус 2,0. Отрегулируйте высоту зубной полосы и ушных баров соответственно.
После этого слегка поднимите шприц и просверлите отверстие с помощью зубной дрели в координатах инъекций. Начните бурить на объекте, работая в круговой и нежной манере. Затем поместите кусок хлопчатобумажной марли на открытый разрез и промойте шприц солевым раствором.
После промывки нарисуйте воздушный пузырь, а затем один микролитер раствора, содержащего вирусный вектор. Убедитесь, что вирусное решение может быть легко визуализированы ниже воздушного пузыря. Далее опустите шприц, медленно продвигаясь на нужную глубину, и убедитесь, что траектория ясна от фрагментов костей.
Впоследствии вводят один микролитер вирусного раствора со скоростью 0,4 микролитров в минуту. Когда инъекция будет сделана, позвольте две минуты для диффузии до снятия шприца. После диффузии медленно убирайте шприц до тех пор, пока кончик капилляра не будет полностью выведен из мозга, затем тщательно навелит разрез и не удалите животное из стереотаксиаической рамы.
Следите за животным на послеоперационной станции до тех пор, пока сознание не будет восстановлено. Животные хранятся в течение 12 недель после инъекции вируса, чтобы резидентов глии перепрограммировать в зрелых нейронов. Для подготовки ломтиков мозга для электрофизиологии с помощью вибромы, раздел мозга от наиболее ростральной части до уровня стриатала на высокой скорости.
Затем раздел стриатум короналли на 275 микрометров на 0,1 миллиметра в секунду. После каждого раздела, тщательно удалите не вводили стриатальной стороны и передачи вводили стороны во флакон с нижней сеткой и кислородом CREB смысле слайд в водяной бане при комнатной температуре. Держите флакон при комнатной температуре до тех пор, пока все секции не будут разрезаны.
После этого медленно увеличьте температуру водяной ванны до 37 градусов по Цельсию и оставьте ее на 30 минут, затем выключите обогреватель и дайте ему остыть до комнатной температуры. После переноса одного участка ткани в камеру записи для электрофизиологии, смонтировать стеклянную пипетку на записывающем электроде и опустить ее в раствор. Перепроверьте сопротивление электрода.
Затем медленно подход перепрограммировать ячейку с пипеткой, сохраняя небольшое положительное давление в электроде, чтобы избежать подключения кончика, и проверить, что клетка GFP положительный перед исправлением. Когда клетка исправлена, поддерживать ячейку в текущем зажиме от минус 60 до минус 70 милливольт, и вводить 500 миллисекундных течений от минус 20 до плюс 90 picoamperes с 10 пикоампер шагом, чтобы вызвать потенциалы действия. Это свидетельствует о созревании нейронов и успешной перепрограммации.
Впоследствии переключитесь на зажим напряжения и измерьте внутренний натрий и отсрочьте исправление калийных течений при деполяризации ступеней в 10 милливольт. Вот пост зарегистрированных биоцитина заполнены перепрограммированный нейрон, который показывает зрелые нейрональной морфологии и дендритных шипов. Здесь электрофизиологические записи перепрограммированных нейронов показывают наличие постсинаптических функциональных связей с мерами спонтанной активности.
Следы показывают ингибирующую активность, которая блокируется пикротоксином, антагонистом рецепторов ГАМК и возбуждающей активностью, которая блокируется с CN'X, антагонистом рецепторов АМРА. Исправленные нейроны уже показывают постсинаптической активности на пять недель после инъекции, и продолжаются на 8 и 12 недель после инъекции. Количество нейронов с текущим индуцированным потенциалом действия также увеличивается с течением времени.
Более подробный анализ выявил несколько различных моделей стрельбы, где большинство клеток показывают быструю пиковую активность, похожую на парвалбуминные интернейроны. Иммуногистохимический анализ на 12 недель далее показал совместное выражение репортера GFP и парвалбумина. После этой процедуры вы можете изучить экспрессию генов с помощью метода поиска патчей или оценить трехмерную синаптической связи с моносинаптической трассировкой и iDISCO.
Теперь, когда можно перепрограммировать резидентов глии в парвалбумин, выражая interneurons, мы начали исследовать, являются ли они подлинными и могут быть использованы в качестве терапевтического инструмента. Не забудьте следовать установленным протоколам и руководящим принципам при обращении с животными и использовании вируса AAV.
