이 프로토콜은 상주 신경교에서 두뇌에 직접 새로운 뉴런을 생성할 수 있고 이 재프로그래밍된 세포가 하위 형 특정 뉴런으로 성숙한다는 것을 보여줍니다. 주요 장점은 NG2-glia와 분석을 위해 다시 프로그래밍된 뉴런에 라벨을 붙이는 GFP 리포터의 특정 타겟팅을 가능하게 하는 cre-의존하는 AAV 바이러스입니다. 두뇌에 있는 새로운 뉴런을 생성하는 것은 두뇌에 있는 세포 보충 치료를 위한 미래 발달로 이끌어 낼 수 있습니다.
우리의 프로토콜에서 우리는 정신 장애에 대한 의미가 parv알부민 양성 인터뉴런을 생성합니다. 생체 내에서 리프로그래밍은 어떤 신경 표현형 및 당신이 표적으로 하고 싶은 신경 조건에 따라서 그밖 두뇌 영역 및 회로에 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 제니 요한슨입니다 : 기술자, 마리아 페레이라 : 전 박사 과정 학생, 마르첼라 Birtele : 우리의 실험실에서 박사 과정 학생.
AAV5 바이러스 벡터를 생성하기 위해 5개의 T175 플라스크에서 표준 배양 배지를 가진 시드 HEK293T 세포. 세포가 50 ~ 70 %의 합류에 도달하면 변환을 위해 다음 혼합을 준비하십시오. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 동일한 양의 벡터 플라스미드와 pDG 시리즈 도우미 플라스미드를 추가합니다.
Tris-EDTA 버퍼를 144 마이크로리터의 최종 부피에 추가한 다음 초순수 수를 추가하여 총 1296마이크로리터를 혼합합니다. 다음으로, 2.5 어금다 칼슘 염화칼슘의 144 마이크로리터를 추가하고 혼합합니다. 그 후, DNA 용액과 소용돌이에 즉시 HBS의 1.92 밀리리터를 추가합니다.
정확히 60 초 동안 실온에서 배양. 이어서, 용액을 신선한 세포 배양 배지의 28 밀리리터로 이송하고 혼합한다. 플라스크의 배지를 트랜스빙 믹스를 포함하는 매체로 바꿉다.
3 일 동안 기다렸다가 미디어를 낭비로 옮기. 각 플라스크에 5밀리리터의 수확 버퍼를 추가한 다음 각 플라스크에 4밀리리터의 DPBS를 추가하여 나머지 셀과 풀을 셀 용액으로 헹구세요. 수확한 세포를 섭씨 4도에서 5분간 1, 000 x g에서 원심분리합니다.
원심 분리 후, 상체를 제거하고 용해 버퍼의 15 밀리리터에 펠릿을 용해. 50 밀리리터 원심분리기 튜브를 드라이 아이스에 15분간 얼리고 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 사용하기 전에 수확한 셀을 섭씨 37도에서 수조에 담근 해동하십시오.
이 절차에서는 iodixanol 그라데이션 극심분리에 의한 AAV 정화를 수행하고 실온에서 1시간 45분 동안 350, 000 x g의 원심분리가 있는 초원심분리기 천장 튜브를 사용합니다. AAV 함유 위상을 추출하려면 10 밀리리터 주사기를 18 게이지 바늘로 삽입하여 40 내지 60%의 위상 테두리 아래 약 2밀리미터에서 배꼽을 위쪽으로 향하고 철회한다. 바이러스 벡터의 5 ~6 밀리리터가 추출 된 후 단백질 밴드에 도달하기 전에 중지해야합니다.
이어서, 희석된 이오디산올 그라데이션을 애니메이션 교환 필터를 통해 정화하고 농축하여 초당 1방울 이하로 빠르게 밀어내지 않는다. 그 후 필터를 통해 IE 버퍼 3밀리리터를 천천히 밀어 씻어내도록 합니다. 다음으로, 용출 버퍼의 1 ~ 2 밀리리터와 원심 필터 단위로 혼합물을 엘테.
장치에 DPBS를 추가하여 4밀리리터의 최종 볼륨에 추가합니다. DPBS의 0.5 밀리리터 미만이 필터에 남아있을 때까지 실온에서 2, 000 x g의 원심분리기. 그 후, 튜브의 바닥에서 액체를 제거하고 DPBS의 4 밀리리터로 리필하고 원심분리기를 다시 작성합니다.
이 단계를 두 번 더 반복하면 필터에 집중된 벡터의 부피가 마지막 원심 분리 후 약 200 마이크로리터인지 확인합니다. 파이펫을 사용하여 200 마이크로리터 농축 벡터를 제거하고 0.22 마이크로미터 필터를 통해 눌러 멸균합니다. 다음으로, aliquot 200 마이크로 리터는 연동 된 삽입 유리 유리 바이알에.
재프로그래밍 요인을 주입하려면 스테레오탁스 프레임에 마취된 마우스를 배치합니다. 수술 초기에 적절한 진통을 투여한 다음 브레그마 바로 위에 주사 바늘의 유리 모세관 끝을 가져옵니다. 모세관 팁이 A-P 와 M-L 평면 모두에서 완벽하게 직선인지 확인하십시오.
디지털 좌표 카운터에서 M-L 및 A-P 값을 모두 0.0으로 재설정합니다. 동물의 머리가 완벽하게 평평한 위치에 있는지 확인하려면 디지털 좌표 카운터를 사용하여 A-P 암이 2.0 및 마이너스 2.0에 있을 때와 M-L 암이 2.0 및 마이너스 2.0에 있을 때 D-V 좌표 값을 측정합니다. 치아 막대와 이어 바의 높이를 그에 따라 조정합니다.
그 후 주사기를 약간 올리고 주사 좌표에서 치과 드릴을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 현장에서 드릴을 시작하여 원형과 부드러운 방식으로 작업합니다. 그런 다음, 열린 절개 위에 면 거즈 조각을 놓고 식염수 용액으로 주사기를 플러시하십시오.
플러싱 후, 바이러스 벡터를 포함하는 용액의 기포와 다음 하나의 마이크로 리터를 그립니다. 바이러스 성 솔루션이 기포 아래에 쉽게 시각화 될 수 있는지 확인하십시오. 다음으로 주사기를 낮추고 원하는 깊이로 천천히 진행하며 궤적이 뼈 조각이 명확하지 않은지 확인합니다.
그 후, 분당 0.4 마이크로리터의 속도로 바이러스 용액의 마이크로리터 1개를 주입한다. 주사가 완료되면 주사기 가출되기 전에 2 분 동안 확산을 허용하십시오. 확산 후, 모세관의 끝이 뇌에서 완전히 철회 될 때까지 주사기를 천천히 철회 한 다음 절개를 조심스럽게 봉합하고 스테레오 테틱 프레임에서 동물을 제거합니다.
의식이 회복 될 때까지 수술 후 역에서 동물을 모니터링합니다. 동물은 최대 보관 12 성숙한 뉴런으로 재프로그래밍 하는 주민 glia 를 허용 하기 위해 바이러스 주입 후 주. 진동을 사용하여 전기 생리학에 대한 뇌 조각을 준비하기 위해, 가장 장밋빛 부분에서 고속으로 줄무늬 수준으로 뇌를 섹션.
그런 다음 striatum을 초당 0.1 밀리미터에서 275 마이크로미터로 관상으로 단면합니다. 각 섹션 후, 신중하게 비 주입 된 striatal 측면을 제거하고 실온에서 수조에 바닥 그물과 산소 CREB 감각 슬라이드와 유리병으로 주입 측을 전송합니다. 모든 섹션이 절단 될 때까지 실온에서 유리병을 유지합니다.
그 후, 천천히 수조의 온도를 섭씨 37도로 높이고 30 분 동안 방치 한 다음 히터를 끄고 실온으로 식힙니다. 전기 생리학을 위한 기록 챔버에 1개의 조직 단면을 전송한 후에, 기록 전극에 유리 파이펫을 장착하고 용액으로 낮춥니까. 전극의 저항을 다시 확인합니다.
그런 다음, 파이펫으로 리프로그래밍된 셀에 천천히 접근하여 전극에 약간의 양압을 유지하여 팁을 연결하지 않도록 하고, 패치 전에 세포가 GFP 양성지있는지 확인합니다. 세포가 패치되면 현재 클램프의 셀을 마이너스 60에서 마이너스 70 밀리볼트로 유지하고, 마이너스 20에서 90 피코아페레스까지 500밀리초 전류를 주입하여 10개의 피코팜페레이 증분을 사용하여 작용 잠재력을 유도한다. 이것은 신경 성숙과 성공적인 재프로그래밍을 나타냅니다.
그 후, 전압 클램프로 전환하고 10 밀리볼트의 탈극 단계에서 내측 나트륨 및 지연 된 정류 칼륨 전류를 측정합니다. 여기에 성숙한 신경 형태와 수지상 척추를 보여주는 재 프로그래밍 된 뉴런을 기록 한 게시물기록입니다. 여기서, 리프로그래밍된 뉴런의 전기생리학적 기록은 자발적인 활동 측정을 가진 포스트냅스 기능적 연결의 존재를 보여준다.
추적은 피크로톡신으로 막힌 억제 활성을 보여 주며, GABAA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제인 CNQX로 막힌 흥분 작용활동을 보여줍니다. 패치 된 뉴런은 이미 5 주 후 주사 후 포스트 냅 스 활동을 표시, 그리고 에서 계속 8 그리고 12 주 후 주입. 현재 유도 된 작용 잠재력을 가진 뉴런의 수는 또한 시간이 지남에 따라 증가합니다.
더 상세한 분석은 세포의 대다수가 parvalbumin interneurons와 유사한 빠른 스파이크 활동을 보여주는 몇몇 명백한 발사 패턴을 제시했습니다. 12주 에서 면역화성 분석은 기자 GFP와 파르살알린의 공동 발현을 보여주었다. 이 절차에 따라 패치 추구 기술로 유전자 발현을 검사하거나 단신분석 추적 및 iDISCO를 통한 3차원 시냅스 연결을 평가할 수 있습니다.
이제 상주 신경교를 인터뉴런을 표현하는 parvalbumin으로 재프로그래밍할 수 있게 되었으므로, 우리는 이들이 정통인지, 치료 도구로 사용될 수 있는지 조사하기 시작했습니다. 동물을 취급하고 AAV 바이러스를 사용할 때 확립된 프로토콜 및 지침을 따르는 것을 기억하십시오.
