نحن نستخدم هذا البروتوكول لجعل خلايا السلف العصبية من الخلايا الليفية الجلد المريض ودراسة الأمراض العصبية والعصبية. نشعر أن هذا البروتوكول لديه الكثير من المزايا على تكنولوجيا IPS الكلاسيكية ، بما في ذلك السرعة ، ولكن أيضا الحصول في بعض الحالات على النمط الظاهري للمرض أكثر حدة. نحن ندرس الأمراض العصبية والعصبية واستخدام عينات الجلد يسمح لنا حقا لتقييم تنوع المرضى كذلك.
مختبري مهتم بشكل خاص بدور الخلايا الفلكية في الأمراض ونحن نستخدم الخلايا الفلكية التي نصنعها من الNPCs لاختبار الأدوية وكذلك لدراسة آليات المرض ، ولكن أيضا في الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية البشرية والفأرة. نأمل أن يكون هذا البروتوكول مفيدا ويرجى التواصل إذا كان لديك أي أسئلة. شكرًا لك.
استخدام الخلايا الليفية الجلد البشري الأولية التي يمكن الحصول عليها من بنوك الخلايا أو خزعات الجلد. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. خلايا المرور لمدة واحد إلى اثنين على الأقل من المقاطع بعد ذوبان الجليد قبل استخدامها في التجربة.
مرة واحدة في الخلايا جاهزة، معطف بئر من لوحة من ستة آبار مع فيبروكتين الإنسان في تركيز 1:200 المخفف في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. إعداد وسائط الخلايا الليفية كما هو موضح في الجدول الأول. عندما تكون الخلايا جاهزة لتكون مطلية، وإزالة فيبروكتين من الطبق وإضافة فورا حل الخلية أو اثنين من ميل من وسائل الإعلام فيبرومبلاست.
لا تدع الطبق يجف قبل إضافة الوسائط. اعتمادا على مدى سرعة نمو الخلايا، لوحة 150، 000 إلى 200، 000 الخلايا الليفية في بئرين من لوحة فيبروكتين الإنسان المغلفة ستة آبار. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
في اليوم التالي للبذر ، تحقق من الخلايا الليفية تحت المجهر وتحقق من أن كثافة الخلية تتراوح بين 70 إلى 85٪ عبر بئر واحد مع جميع ناقلات الفيروسات الرجعية الأربعة: Oct3/4 ، Klf4 ، Sox2 ، و c-Myc. استخدام عدد كبير من العدوى من 10 للنمو السريع أو 15 للخلايا الليفية بطيئة النمو. يجب أن تتجاوز كفاءة النقل 70٪ أو أكثر من الخلايا الإيجابية لكل متجه.
إضافة العادية الليفية المتوسطة إلى مزيج الفيروسية لحجم إجمالي قدره مليون واحد لكل بئر. اترك البئر الثاني دون علاج وأعيد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة لاحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي لاتحميل, غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة واحدة ميل وسائل الإعلام الليفية الطازجة.
خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم التالي، وإعداد وسائل الإعلام التحويل كما هو مبين في الجدول الأول وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني للتخلص من وسائل الإعلام الليفية المتبقية، ثم إضافة ميل واحد من متوسط التحويل. تغيير وسائل الإعلام من البئر غير المعالجة لتحويل وسائل الإعلام أيضا.
مراقبة الخلايا تحت المجهر ومشاهدة التغيرات في مورفولوجيا. وينبغي استبدال الوسائط الخلوية يوميا طوال عملية التحويل بوسائط تحويل واحدة إلى اثنتين وثقافة iNPC اللاحقة. تغيير الوسائط عن طريق إزالة الوسائط 70٪ بعناية من البئر مع التأكد من أن الخلايا تظل مغطاة في 30٪ المتبقية من الوسائط.
الاستمرار في مراقبة الخلايا وتغيير وسائل الإعلام يوميا مع واحد إلى اثنين من ميل من وسائل الإعلام التحويل. بعد حوالي خمسة إلى ستة أيام في وسائط التحويل أو عندما تصبح الخلايا كثيفة جدا ، مرورها من واحد إلى اثنين أو كحد أقصى واحد إلى ثلاثة. الاحماء Accutase ومعطف عدد مناسب من الآبار في لوحة من ستة آبار مع واحد ميل مجموع فيبروكتين المخفف 1:200 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
غسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني دون فصل أي خلايا. استخدام جدار البئر لتطبيق برنامج تلفزيوني بلطف على الخلايا. إزالة برنامج تلفزيوني بعناية مع ماصة أو عن طريق التجسس.
إضافة 500 ميكرولتر اكوتاز واحتضان 2-3 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن معظم الخلايا قد انفصلت. إذا كانت الخلايا قد حان قبالة، إضافة اثنين من ميل من وسائل الإعلام تحويل جديدة وماصة بلطف صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات إلى كتل ينفصم.
جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وإضافة وسائل الإعلام ثلاثة ميلس لمزيد من التخفيف من Accutase. جهاز طرد مركزي لمدة أربع دقائق في 200 G في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant من بيليه الخلية وإعادة إنفاق الخلايا في ميل واحد من المتوسطة الطازجة.
ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات لحل كتل الخلية. إزالة فيبروكتين من ست آبار المغلفة وإضافة وسائل الإعلام واحد ميل الطازجة إلى كل بئر على الفور. للحصول على نسبة انقسام 1:2، أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في بئر واحد والآخر 500 في بئر ثاني.
توزيع الخلايا عن طريق هز بلطف البئر الستة في الاتجاه الشمالي الجنوبي الشرقي الغربي ووضع في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة. مراقبة الخلايا تحت المجهر في اليوم التالي وتغيير وسائل الإعلام مع 1-2 ميل. تغيير الوسائط كل يوم حتى تصبح الخلايا جاهزة للانقسام مرة أخرى.
إعداد وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه التي تحتوي على FGF في زيادة التركيز دون EGF أو الهيبارين كما رأينا في الجدول الأول. في هذا الانقسام الجديد ، والبذور بئر واحد من الخلايا في وسائل الإعلام التحويل والآخر جيدا في وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه. الحفاظ على تغيير وسائل الإعلام من الشخصيات الوطنية يوميا مع واحد إلى اثنين من ميل من وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه.
إعداد وسائل الإعلام الخلايا الفلكية وفقا للجدول الأول. لجعل الخلايا الفلكية من الشخصيات الجديدة، البذور iNPCs مباشرة في 10 ميل من وسائل الإعلام astrocyte في 10 سم فيبروكتين المغلفة لوحات بحيث تكون حوالي 10٪ التقاء في اليوم التالي. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
تغيير المتوسطة مع 10 ميل من وسائل الإعلام astrocyte بعد ثلاثة أيام من الطلاء. الحفاظ على الخلايا التفريق لمدة خمسة إلى سبعة أيام. للبذور للتجريب، وتقسيم الخلايا الفلكية باستخدام تريبسين أو أكوتاسي كما هو موضح في الخطوة 2 إلى 2.6.
يتم تضمين كثافات البذر الموصى بها في الجدول الثاني. توجد إرشادات حول كيفية تقسيم iNPCs لإنشاء الخلايا الفلكية المستحثة في الجدول الثالث. لجعل الخلايا الفلكية من مخزونات iNPC المجمدة، وإزالة ملف مخزون جزء من خزان النيتروجين السائل وتذوب بسرعة في 37 درجة مئوية.
بمجرد أن يتم إذابة الخلايا، محلول الخلية ماصة في أنبوب 15 ميل تحتوي على خمسة ميل من وسائل الإعلام astrocyte. جهاز طرد مركزي لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة 200 غرام. إزالة supernatant وإعادة الإنفاق في واحد ميل المتوسطة astrocyte الطازجة.
إضافة تسعة ميلس المتوسطة astrocyte الطازجة إلى طبق فيبروكتين المغلفة 10 سم وإضافة محلول واحد خلية ميل، وتوزيع الخلايا بلطف في حركة الشمال والجنوب الشرقي الغربي. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. يسمح هذا البروتوكول بالجيل السريع والسهل من الشخصيات غير المناهمة مباشرة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية باستخدام الفيروسات الرجعية التي تحتوي على عوامل ياماناكا.
تسمح هذه الطريقة بتجاوز حالة الخلايا الجذعية والحاجة إلى التحديد الكلوني ، وبالتالي تجنب الاختلاف اللاستنساخي. الخطوات الهامة التي يجب وضعها في الاعتبار أثناء خضوع الخلايا لعملية التحويل هي كثافة البذر في الخلايا الليفية ، و درجة الحموضة في الوسائط ، والحفاظ على الخلايا في التقاء أمثل. ويمكن الاطلاع على أمثلة على التغيرات المثلى في التقاء ومورفولوجيا أثناء عملية التحويل في الشكل الأول.
بعد اكتمال عملية التحويل ، ستظهر الشخصيات التعبير المنخفض بقوة أو عدم وجود تعبير عن علامات الخلايا الليفية والمورفولوجيا والتعبير عن علامات الخلايا الخاصة بالمجلس الوطني للصحافه. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لتوليد خطوط الخلايا المختلفة مثل الخلايا العصبية المستحثة، oligodendrocytes، والخلايا الفلكية. في تجربتنا، الخلايا الفلكية المستحثة على وجه الخصوص هي قيمة جدا لاختبار آلية المخدرات والمرض لأنها يمكن أن تتولد في مجموعات نقية بأعداد كبيرة قابلة للاستنساخ.
يمكن تمييز الخلايا الفلكية المستحثة عن الشخصيات غير المتشحمية عن طريق أخذ aaliquot صغيرة من الخلايا أثناء تقسيم أو جزء iNPC المجمدة سابقا والطلاء مباشرة في وسائل الإعلام astrocyte. اعتبارات هامة خلال هذه العملية هي الحفاظ على كثافة البذر الأولية iNPCs منخفضة كما ثبت كثافة البذر عالية لعرقلة عملية التمايز، وإيلاء اهتمام إضافي لرقم الحموضة وسائل الإعلام كما التحمض يمكن تنشيط حتى الخلايا الفلكية صحية. باختصار، بروتوكول التحويل المباشر هو طريقة سريعة جدا لتكون قادرة على جعل خلايا السلف العصبية من عينات جلد المريض.
وهذا يسمح لدراسة عدد أكبر من عينات الخلايا في نفس الوقت والنظر حقا في التنوع في سياق المرض. نشعر أن هذا هو المقايسة قوية جدا التي يمكنك استخدامها لجعل خلايا السلف العصبية، والخلايا العصبية، ولكن أيضا الخلايا الفلكية التي يمكن استخدامها بعد ذلك إما في الثقافة المشتركة أو من تلقاء نفسها لاختبار المخدرات أو الدراسات الميكانيكية كذلك.
