البروتوكول الحالي مهم لأنه يسمح للباحثين بإنتاج جسيمات نانوية محملة بالسيرنا، وتوصيف هذه الجسيمات النانوية بشكل كاف لضمان ملاءمتها للإدارة للحيوانات قبل الدراسات اللاحقة. وميزة هذا النهج هي إنتاج جسيمات نانوية تزيد من التوافر البيولوجي للرنا وإنتاج جسيمات نانوية مشحونة بشكل محايد وبالتالي مناسبة للإدارة النظامية. هذه التقنية هي مؤثرة لأن جسيمات نانوية سيرنا يمكن تطبيقها لعلاج عدد لا يحصى من الأمراض التي تستلزم الإدارة الجهازية بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية واضطرابات المناعة الذاتية ، من بين أمور أخرى.
للبدء، حل البوليمر في الإيثانول بتركيز 33.3 ملليغرام لكل ملليلتر ويحرك لضمان حل. ثم استخدام ماصة لنقل حل البوليمر في 10 ميليمولار حمض الستريك العازلة للوصول إلى تركيز 3.33 ملليغرام لكل ملليلتر. إضافة الماء المقطر في أنبوب يحتوي على تدخل الجيش الملكي النيبالي الصغيرة لتحقيق تركيز 50 ميكرومولار.
خلط البوليمر والصغيرة تتدخل RNA الحلول بدقة في أنبوب عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لتحقيق نسبة النيتروجين إلى الفوسفات من 10. ضع الأنبوب في درجة الحرارة المحيطة لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة ملليلتر واحد من 10 ملليمتر الفوسفات العازلة في درجة اله PH ثمانية إلى أنبوب لتحقيق تركيز 0.28 ملليغرام لكل ملليلتر ومزيج بلطف إما عن طريق الأنابيب أو عكس الأنبوب.
للتأكد من أن الأسي هيدروليكي النهائي محايد، حوالي 7.2 إلى 7.5، ماصة 10 ميكرولترات من جسيمات نانوية تدخل صغيرة الحمض النووي الريبي حل على شرائط اختبار الأسي هيدروليك. أولاً، إعداد عينة تشتت الضوء الديناميكية عن طريق تصفية ملليلتر واحد من الجسيمات النانوية الحمض النووي الريبي الصغيرة عند تركيز 0.28 ملليغرام لكل ملليلتر من خلال 0.45 ميكرومتر المسام حجم مرشحات حقنة في الكوارتز مربع أو البوليسترين cuvette. ثم قياس حجم السجل وقياسات تهمة السطح باستخدام أداة تشتت الضوء الديناميكية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
لتأكيد حجم ومورفولوجيا جسيمات نانوية RNA الصغيرة التداخلية باستخدام المجهر الإلكترون الإرسال أولاً إضافة خمسة ميكرولترات من محلول جسيمات نانوية RNA صغيرة مُنصفة عند 0.28 ملليغرام لكل ملليلتر لكل شبكة TEM. ضع الشبكات في درجة الحرارة المحيطة لمدة 60 ثانية. لطخة جافة مع ورقة مرشح لمدة ثلاث ثوان.
المقبل، إضافة خمسة ميكروليترات من 3٪ محلول خلات uranyl إلى كل شبكة واحتضان لمدة 20 ثانية. بقعة جافة لمدة ثلاث ثوان. ثم ضع الشبكات في مجفف لتجف بين عشية وضحاها قبل التصوير تحت المجهر الإلكترون انتقال.
لأداء تأخر جل agarose ، أولا إضافة غرامين من مسحوق agarose الكهربائية الصف إلى 100 ملليلتر من 1X تريس - خلات - EDTA العازلة في درجة الH ثمانية في منقار لإنتاج 2 ٪ agarose هلام. اثارة لتعليق agarose. ضع القارق المكتشف في ميكروويف لتسخين لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق حتى يتم حل جميع agarose.
مرة واحدة تبريد، إضافة خمسة ميكرولترات من بروميد الإتيهيدوم بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر في القارص وخلط جيدا. ثم صب agarose في علبة هلام ووضع مشط لإنتاج الآبار. دع الجل يجف لمدة 30 دقيقة.
قم بإزالة المشط بعناية لترك آبار التحميل خلفك، وصب 1X Tris-Acetate-EDTA في علبة الجل لملء الحد الأقصى لخط التعبئة. ثم ضع اثنين من aliliter microliter من صبغة التحميل مع عدم وجود SDS أو تقليل العوامل على فيلم البارافين لكل صياغة جسيمات نانوية RNA صغيرة التداخل في نسب النيتروجين إلى الفوسفات المختلفة. ماشيت لخلط 10 ميكرولترات صغيرة تتدخل الحمض النووي الريبي حل نانو جسيمات مع تحميل صبغة على فيلم البارافين.
يُضاف الخليط إلى آبار أجاروز جل. قم بتوصيل نظام الكهرباء بمصدر طاقة وتشغيل مصدر جهد 100 فولت لمدة 35 دقيقة أو حتى تجتاز العينات 80٪ من طول الجل. نقل الجل من علبة إلى transilluminator الأشعة فوق البنفسجية وتصور العصابات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
تحديد النسبة المثلى النيتروجين إلى الفوسفات على أساس اختفاء عصابات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة في الجزء السفلي من هلام. لضرب لوسيفيراز الجينات نموذج, البذور الأولى luciferase التعبير عن الخلايا في لوحة 96-جيدا سوداء مسورة مع DMEM في 10٪ FBS في كثافة 2,000 الخلايا في بئر. ضع اللوحة في حاضنة بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالتمسك.
في الصباح إزالة وسائل الإعلام وإضافة 10 ميكرولترات لكل بئر من جسيمات نانوية الحمض النووي الريبي الصغيرة تضعف في وسائل الإعلام المصل الكامل لتركيز الحمض النووي الريبي التدخلية الصغيرة النهائية من 100 نانوموللار. إعادة الآبار إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة لعلاج الخلايا مع جسيمات نانوية الحمض النووي الريبي الصغيرة التداخل. في اليوم التالي، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام المصل الكامل تحتوي على 150 ميكروغرام لكل ملليلتر D-luciferin.
احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل قياس الإنارة على قارئ لوحة. ثم كرر المرطبات وسائل الإعلام مرتين مع وسائل الإعلام مصل كامل جديد خالية من D-luciferin, تليها الحضانة لمدة 24 ساعة. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام مصل كامل تحتوي على 150 ملليغرام لكل ملليلتر D-luciferin واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
قياس الإنارة عند نقطة الوقت 48 ساعة. للدراسات الطولية، وترك غطاء على رأس لوحة البئر عندما خارج مجلس الوزراء السلامة الحيوية للحفاظ على الخلايا في ظل ظروف معقمة ومواصلة الحضانة بعد استبدال وسائل الإعلام التي تحتوي على لوسيفيرين مع وسائل الإعلام الكاملة الطازجة. تظهر قياسات تشتت الضوء الديناميكية أن جسيمات نانوية صغيرة تدخلها RNA واحدة يبلغ قطرها 35 نانومترًا.
وجود ذروة واحدة مع عرض الذروة الضيقة يشير إلى توزيع أحادي الواسطة وانخفاض تعدد التخصصات. تؤكد قياسات TEM قياس الحجم من تشتت الضوء الديناميكي يشير إلى وجود مجموعة موحدة من الجسيمات النانوية الحمض النووي الريبي الصغيرة وكشف عن مورفولوجيا كروية للجسيمات النانوية الحمض النووي الريبي الصغيرة. نتج تركيز عال جدا من البوليمر في التحضير خطوة لصغر التداخل RNA جسيمات نانوية اثنين في قطر غير مرغوب فيه من أكبر من 200 نانومتر, متعدد الوسائط والسكان متعددة الفئات, والمجاميع في حل تشكيل لا مورفولوجيا الجسيمات متميزة.
كلا صغير التداخل RNA الجسيمات النانوية واحد واثنين من عرض شحنة سطح محايدة المشار إليها من قبل ما يقرب من الصفر يعني القيم المحتملة زيتا. أغاروز هلام تأخر فحص يظهر اختفاء صغيرة تدخل رنا العصابات في أسفل هلام مما يدل على تعقيد الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة إلى البوليمر. البوليمر معقدة تدخل الجيش الملكي النيبالي الصغيرة غير قادر على الهجرة من خلال هلام، وبالتالي تصور في الجزء العلوي من هلام قريب من آبار التحميل.
كما يتم زيادة النيتروجين إلى الفوسفات نسبة صغيرة تتدخل RNA التعقيد يزيد كما هو مبين من قبل انخفاض كثافة صغيرة تدخل RNA الفرقة في أسفل هلام. لوكافيراز النشطة بيولوجيا صغيرة تتدخل RNA نانو جسيمات واحدة معارض تقلص بشكل كبير نشاط لوسيفيراس بالمقارنة مع السيطرة المشوشة. في المقابل، لوسيفيراز الصغيرة تتدخل دنا نانو جسيمات اثنين لا تعتبر نشطة بيولوجيا.
لإنتاج جسيمات نانوية متسقة مع الخصائص الفيزيائية الكيميائية المطلوبة، يجب استخدام حلول البوليمر مع التركيزات المناسبة والتحقق من صحة الرقم الH من حلول العازلة في كل خطوة من البروتوكول. باستخدام هذه الطرق في بحثنا كنا قادرين على إنتاج العلاجات القائمة على جسيمات نانوية من الرنا للجينات المسببة للسرطان التي لم تكن قابلة للاجهاد من قبل واختبار فعالية هذه العلاجات في النماذج السابقة السريرية لسرطان الثدي.
