הפרוטוקול הנוכחי הוא משמעותי משום שהוא מאפשר לחוקרים לייצר חלקיקים טעונים siRNA, ולאפיין כראוי חלקיקים אלה כדי להבטיח את התאמתם לניהול לבעלי חיים לפני מחקרים עתידיים. היתרון של גישה זו הוא לייצר חלקיקים המגדילים את הזמינות הביולוגית של siRNA ולייצר חלקיקים טעונים באופן ניטרלי ובכך מתאימים לניהול מערכתי. טכניקה זו היא השפעה כי חלקיקי siRNA ניתן ליישם לטיפול מספר עצום של מחלות המחייבות ניהול מערכתי כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, והפרעות אוטואימוניות, בין היתר.
כדי להתחיל, להמיס פולימר באתנול בריכוז של 33.3 מיליגרם למיליליטר ומערבבים כדי להבטיח פירוק. לאחר מכן השתמש פיפטה להעביר פתרון פולימר 10 מילימולרית חומצה ציטרית חיץ להגיע לריכוז של 3.33 מיליגרם למיליליטר. הוסף מים מזוקקים לתוך צינור המכיל RNA מפריע קטן כדי להשיג ריכוז של 50 micromolar.
מערבבים את הפולימר ופתרונות RNA מפריעים קטנים ביסודיות בצינור על ידי צינור למעלה ולמטה כדי להשיג יחס חנקן לפוספט של 10. מניחים את הצינור בטמפרטורת הסביבה במשך 30 דקות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ פוספט 10 מילימולרים ב- pH שמונה לצינור כדי להשיג ריכוז של 0.28 מיליגרם למיליליטר ומערבבים בעדינות על ידי צינורות או היפוך הצינור.
כדי לאשר כי ה- pH הסופי הוא ניטרלי, סביב 7.2 כדי 7.5, פיפטה 10 microliters של פתרון חלקיקי RNA מפריעים קטנים על רצועות בדיקת pH. ראשית, להכין מדגם פיזור אור דינמי על ידי סינון מיליליטר אחד של חלקיקי RNA מפריעים קטנים בריכוז של 0.28 מיליגרם למיליליטר דרך 0.45 מיקרומטר גודל נקבובית מסנני מזרק לתוך קוורץ מרובע או cuvette פוליסטירן. לאחר מכן הקליטו מדידות גודל וטעינה על פני השטח באמצעות מכשיר פיזור אור דינמי בהתאם למפרטי היצרן.
כדי לאשר את הגודל והמורפולוגיה של חלקיקי RNA קטנים מפריעים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור להוסיף תחילה חמישה microliters של פתרון חלקיקי RNA קטנים מפריעים מסוננים ב 0.28 מיליגרם למיליליטר לכל רשת TEM. מניחים את הרשתות בטמפרטורת הסביבה למשך 60 שניות. כתם יבש עם נייר סינון למשך שלוש שניות.
לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תסנובת אצטט 3%uranyl לכל רשת ודגירה למשך 20 שניות. כתם יבש במשך שלוש שניות. ואז למקם את הרשתות במייבש להתייבש לילה לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
כדי לבצע פיגור ג'ל אגרוז, תחילה להוסיף שני גרם של אבקת אגרוז אלקטרופורזה כיתה ל 100 מיליליטר של חיץ 1X טריס אצטט-EDTA ב pH שמונה ב beaker לייצר 2%agarose ג'ל. מערבבים להשעות את ההתעוררות. מניחים את המזווה שנחשף במיקרוגל כדי לחמם במשך 1 עד 3 דקות עד שכל אגרוז מומס.
לאחר הקירור, מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של אתידיום ברומיד בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר לתוך הקוסם ומערבבים היטב. לאחר מכן יוצקים את ההתעוררות לתוך מגש ג'ל ומ מניחים מסרק כדי לייצר בארות. תן לג'ל להתייבש במשך 30 דקות.
בזהירות להסיר את המסרק להשאיר מאחור טעינת בארות, ויוצקים 1X טריס אצטט-EDTA מאגר לתוך מגש ג'ל למלא את קו המילוי המרבי. לאחר מכן מניחים שני aliquots microliter של טעינת צבע ללא SDS או הפחתת סוכנים על סרט פרפין עבור כל ניסוח חלקיקי RNA מפריע קטן ביחסי חנקן לפוספט שונים. פיפטה לערבב 10 microliters של פתרון חלקיקי RNA קטן מפריע עם טעינת צבע על סרט פרפין.
מוסיפים את התערובת ל בארות ג'ל אגרוז. חבר את מערכת האלקטרופורזה לאספקת חשמל והפעל מקור מתח ב- 100 וולט למשך 35 דקות או עד שהדגימות חצו 80% מאורך הג'ל. מעבירים את הג'ל מהמגש לטרנסילומינטור UV ומדמיין את רצועות ה-RNA המפריעות הקטנות על טרנסילומינטור UV בהתאם למפרט היצרן.
לקבוע את יחס החנקן האופטימלי פוספט מבוסס על היעלמות של להקות RNA מפריעות קטנות בתחתית הג'ל. כדי להפיל את הגן מודל luciferase, הראשון זרע לוסיפראז הבעת תאים בצלחת 96 היטב שחור מוקף עם DMEM ב 10%FBS בצפיפות של 2, 000 תאים לגם. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור לילה כדי לאפשר לתאים לדבוק.
בבוקר להסיר מדיה ולהוסיף 10 microliters לכל באר של חלקיקי RNA מפריעים קטנים מדולל לתוך מדיה סרום מלא עבור ריכוז RNA מפריע קטן סופי של 100 ננומולרים. מחזירים את בארות החממה במשך 24 שעות כדי לטפל בתאים עם חלקיקי RNA מפריעים קטנים. למחרת, החלף מדיה במדיה מלאה בסרום המכילה 150 מיקרוגרם למיליליטר D-luciferin.
דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני מדידת זוהר על קורא צלחת. לאחר מכן חזור על רענון המדיה פעמיים עם מדיה סרום מלא טרי ללא D-luciferin, ואחריו דגירה במשך 24 שעות. החלף את המדיה במדיה מלאה בסרום המכילה 150 מיליגרם למיליליטר D-luciferin ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
למדוד זוהר בנקודת הזמן של 48 שעות. עבור מחקרים אורך, להשאיר את המכסה על גבי צלחת היטב כאשר מחוץ לארון biosafety כדי לשמור על תאים בתנאים סטריליים ולהמשיך את הדגירה לאחר החלפת מדיה המכילה לוציפרין עם מדיה מלאה טרייה. מדידות פיזור אור דינמי מראות כי קטן מפריע RNA חלקיק אחד יש קוטר ממוצע של 35 ננומטר.
הנוכחות של שיא יחיד עם רוחב שיא צר מצביעה על התפלגות חד-מוגדיאלית ופולידיספרסיות נמוכה. מדידות TEM מאשרות את מדידת הגודל מתפזרות אור דינמית מרמזת על נוכחות של אוכלוסייה אחידה של חלקיקי RNA קטנים מפריעים וחשפה את המורפולוגיה הכדורית של חלקיקי ה- RNA המפריעים הקטנים. ריכוז גבוה מדי של פולימר בשלב ההכנה הביא קטן להתערב RNA חלקיקים שניים בקוטר לא רצוי של יותר מ 200 ננומטר, אוכלוסייה multimodal ו polydispersed, אגרגטים בפתרון להרכיב שום מורפולוגיה חלקיקים ברורה.
שני חלקיקי RNA קטנים מפריעים אחד ושניים להציג מטען משטח ניטרלי מסומן על ידי כמעט אפס ממוצע ערכי זטה פוטנציאליים. בדיקת פיגור ג'ל אגרוז מראה את היעלמותן של להקות RNA קטנות מפריעות בתחתית הג'ל, מה שמצביע על קומפלקסציה של רנ"א קטן ומפריע לפולימר. פולימר מורכב RNA מפריע קטן אינו מסוגל לנדוד דרך הג'ל ולכן הוא דמיין בחלק העליון של הג'ל הסמוך בארות טעינה.
כמו יחס חנקן לפוספט הוא גדל קטן מפריע RNA קומפלקסציה עולה כפי שצוין על ידי ירידה בעוצמה של רצועת RNA מפריע קטן בתחתית הג'ל. לוציפראז ביואקטיבי קטן מפריע RNA חלקיק אחד מציג באופן משמעותי פחתה פעילות לוציפראז בהשוואה לשליטה מקושקשת. לעומת זאת, לוציפראז קטן מפריע RNA חלקיקים 2 אינו נחשב ביואקטיבי.
כדי לייצר חלקיקי siRNA עקביים עם תכונות פיזיוכימיות רצויות, יש להשתמש בפתרונות פולימר עם ריכוזים מתאימים ולאמת את ה- pH של פתרונות החיץ בכל שלב של הפרוטוקול. באמצעות שיטות אלה במחקר שלנו הצלחנו לייצר טיפולים מבוססי ננו-חלקיקים siRNA עבור גנים גורמי סרטן בעבר בלתי ניתנים לשחזור ולבדוק את היעילות של טיפולים אלה במודלים פרה-קליניים של סרטן השד.
