L'attuale protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di produrre nanoparticelle cariche di siRNA e di caratterizzare adeguatamente queste nanoparticelle per garantire la loro idoneità alla somministrazione agli animali prima di studi successivi. Il vantaggio di questo approccio è quello di produrre nanoparticelle che aumentano la biodisponibilità del siRNA e di produrre nanoparticelle che sono cariche in modo neutro e quindi adatte alla somministrazione sistemica. Questa tecnica ha un impatto perché le nanoparticelle di siRNA possono essere applicate per trattare una miriade di malattie che richiedono una somministrazione sistemica tra cui cancro, malattie cardiovascolari e disturbi autoimmuni, tra gli altri.
Per iniziare, sciogliere il polimero in etanolo a una concentrazione di 33,3 milligrammi per millilitro e mescolare per garantire la dissoluzione. Quindi utilizzare una pipetta per trasferire la soluzione polimerica in tampone di acido citrico millimolare da 10 millimolare per raggiungere una concentrazione di 3,33 milligrammi per millilitro. Aggiungere acqua distillata in un tubo contenente un piccolo RNA interferente per ottenere una concentrazione di 50 micromolari.
Mescolare accuratamente il polimero e le piccole soluzioni di RNA interferente in un tubo tubazione su e giù per ottenere un rapporto azoto-fosfato di 10. Posizionare il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di fosfato millimolare a pH otto al tubo per ottenere una concentrazione di 0,28 milligrammi per millilitro e mescolare delicatamente pipettando o invertendo il tubo.
Per confermare che il pH finale è neutro, intorno a 7,2 a 7,5, pipetta 10 microlitri della piccola soluzione di nanoparticelle di RNA interferenti sulle strisce di prova del pH. In primo luogo, preparare un campione dinamico di dispersione della luce filtrando un millilitro di piccole nanoparticelle di RNA interferenti alla concentrazione di 0,28 milligrammi per millilitro attraverso filtri a siringa di dimensioni dei pori di 0,45 micrometri in una cuvetta quadrata di quarzo o polistirolo. Quindi registrare le misure di dimensione e carica superficiale utilizzando uno strumento di dispersione dinamica della luce secondo le specifiche del produttore.
Per confermare le dimensioni e la morfologia delle piccole nanoparticelle di RNA interferenti usando la microscopia elettronica a trasmissione, aggiungere prima cinque microlitri di piccola soluzione di nanoparticelle di RNA interferente filtrata a 0,28 milligrammi per millilitro ad ogni griglia TEM. Posizionare le griglie a temperatura ambiente per 60 secondi. Asciugare con carta da filtro per tre secondi.
Aggiungere quindi cinque microlitri di soluzione di acetato di 3%uranil a ciascuna griglia e incubare per 20 secondi. Asciugare per tre secondi. Quindi posizionare le griglie in un essiccatore per asciugare durante la notte prima dell'imaging sotto microscopia elettronica a trasmissione.
Per eseguire il ritardo del gel di agarosio, aggiungere prima due grammi di polvere di agarosio di grado elettroforesi a 100 millilitri di tampone 1X Tris-acetato-EDTA a pH otto in un bicchiere per produrre gel di agarosio al 2%. Mescolare per sospendere l'agarosio. Posizionare il becher scoperto in un forno a microonde per riscaldare per uno o tre minuti fino a quando tutto l'agarosio non viene sciolto.
Una volta raffreddato, aggiungere cinque microlitri di bromuro di etidio alla concentrazione di 10 milligrammi per millilitro nel becher e mescolare bene. Quindi versare l'agarosio in un vassoio di gel e posizionare il pettine per produrre pozzi. Lasciare asciugare il gel per 30 minuti.
Rimuovere con cura il pettine per lasciare i pozzatti di carico e versare 1X Tris-acetato-EDTA tampone nel vassoio gel per riempire alla linea di riempimento massima. Quindi posizionare due aliquote microliter di colorante di carico senza SDS o agenti riducenti su pellicola di paraffina per ogni piccola formulazione di nanoparticelle di RNA interferente a diversi rapporti azoto-fosfato. Pipetta per mescolare 10 microlitri di piccola soluzione di nanoparticelle di RNA interferente con colorante di carico su pellicola di paraffina.
Aggiungere la miscela ai pozzi di gel di agarosio. Collegare il sistema di elettroforesi a un alimentatore ed eseguire la sorgente di tensione a 100 volt per 35 minuti o fino a quando i campioni non hanno attraversato l'80% della lunghezza del gel. Trasferire il gel dal vassoio a un transilluminatore UV e visualizzare le piccole bande di RNA interferenti sul transilluminatore UV secondo le specifiche del produttore.
Determinare il rapporto ottimale azoto/fosfato in base alla scomparsa di piccole bande di RNA interferenti sul fondo del gel. Per abbattere il modello gene luciferasi, le prime cellule che esprimono luciferasi di semi in una piastra con pareti nere a 96 pozzi con DMEM nel 10%FBS ad una densità di 2.000 cellule per pozzo. Posizionare la piastra in un'incubatrice durante la notte per consentire alle cellule di aderire.
Al mattino rimuovere i mezzi e aggiungere 10 microlitri per pozzo di piccole nanoparticelle di RNA interferenti diluite in mezzi sieri completi per una piccola concentrazione finale di RNA interferente di 100 nanomolari. Restituire i pozzi all'incubatrice per 24 ore per trattare le cellule con piccole nanoparticelle di RNA interferenti. Il giorno successivo, sostituire i supporti con mezzi sieri completi contenenti 150 microgrammi per millilitro D-luciferina.
Incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti prima di misurare la luminescenza su un lettore di piastre. Quindi ripetere il ristoro multimediale due volte con mezzi di siero freschi e pieni senza D-luciferina, seguiti da incubazione per 24 ore. Sostituire il supporto con mezzi sieri completi contenenti 150 milligrammi per millilitro D-luciferina e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Misurare la luminescenza al punto di 48 ore. Per studi longitudinali, lasciare il coperchio sopra la piastra del pozzo quando si è all'esterno dell'armadio di biosicurezza per mantenere le cellule in condizioni sterili e continuare l'incubazione dopo aver sostituito i mezzi contenenti luciferina con mezzi freschi e pieni. Le misurazioni dinamiche dello scattering della luce mostrano che una piccola nanoparticella di RNA interferente ha un diametro medio di 35 nanometri.
La presenza di un singolo picco con larghezza di picco stretta indica distribuzione unimodale e bassa polidispersità. Le misurazioni TEM confermano che la misurazione delle dimensioni dallo scattering dinamico della luce suggerisce la presenza di una popolazione uniforme di piccole nanoparticelle di RNA interferenti e rivelano la morfologia sferica delle piccole nanoparticelle di RNA interferenti. Una concentrazione troppo elevata di polimero nella fase di preparazione ha portato a piccole nanoparticelle di RNA interferenti due con diametro indesiderato superiore a 200 nanometri, una popolazione multimodale e polidispersa e aggregati in soluzione che non formano morfologia distinta delle particelle.
Entrambe le piccole nanoparticelle di RNA interferenti una e due mostrano una carica superficiale neutra indicata da valori potenziali zeta medi vicini allo zero. Il test di ritardo del gel di agarosio mostra la scomparsa di piccole bande di RNA interferenti sul fondo del gel che indica la complessità di piccoli RNA interferenti in polimero. Il piccolo RNA interferente complesso polimerico non è in grado di migrare attraverso il gel e viene quindi visualizzato nella parte superiore del gel vicino ai pozzi di carico.
Man mano che il rapporto azoto/fosfato aumenta la piccola complessità dell'RNA interferente aumenta come indicato dalla diminuzione dell'intensità della piccola banda di RNA interferente sul fondo del gel. La piccola nanoparticella di RNA interferente bioattiva mostra un'attività della luciferasi significativamente diminuita rispetto al controllo strapazzato. Al contrario, la piccola nanoparticella di RNA interferente luciferasi due non è considerata bioattiva.
Per produrre nanoparticelle di siRNA coerenti con le proprietà fisicochimiche desiderate, si dovrebbero utilizzare soluzioni polimeriche con concentrazioni appropriate e convalidare il pH delle soluzioni tampone in ogni fase del protocollo. Usando questi metodi nella nostra ricerca siamo stati in grado di produrre terapie basate su nanoparticelle di siRNA per geni precedentemente indisciplinabili che causano il cancro e testare l'efficacia di queste terapie in modelli preclitici di cancro al seno.
