بروتوكول NanoDispenser المستندة إلى وضع وصف في هذا الفيديو يمثل أول طريقة سهلة الاستخدام، عالية الإنتاجية transfection السماح حتى للمبتدئين في هذا المجال لتكون ناجحة. هذا هو سهل على تقنية عالية الإنتاجية يسمح transfection الخلية مع شرط مستقل 384. اعتبارا من الآن، فإن الأسلوب هو انخفاض التكلفة نظرا لحجم نانو من الكاشف اللازمة.
لتحديد أفضل معلمات نقل لجميع أنواع الخلايا، نقترح الحفاظ على تركيز الحمض النووي المصدر ثابت، واستخدام كميات مختلفة من الحمض النووي المصاب، كاشف العدوى، وعدد الخلايا. للاستغناء عن 40 microliter تعليق الخلية ، تحميل 10 ميكرولتر كاسيت على جهاز معالج السائل المتعامد ، وإعداد برنامج مناسب. أولاً، ضبط معلمة معدل التدفق إلى مستوى منخفض للاستغناء عن الخلايا ذات السرعة المنخفضة لتجنب تعزيز الضرر المحتمل للخلايا بسبب الإجهاد الهائل والتأثير العالي على قاع الآبار.
ثم، ضبط ارتفاع الاستغناء إلى 11.43 ملليمتر. يجب أن يكون الارتفاع مرتفعًا بما يكفي لخفض تأثير الخلية على الجزء السفلي من الآبار أثناء عملية الاستغناء ، ولكنه منخفض بما يكفي لتجنب الاحتفاظ بالقطيرات على رأس الاستغناء. بعد ذلك، ضبط ارتفاع لوحة واضحة إلى 16 ملليمتر للسماح التشريد الحرة من رئيس الاستغناء على لوحة بعد الاستغناء عن كل صف.
التحكم بصريا في الإعدادات المناسبة لارتفاع الرأس معالج السائل ال peristaltic. تأكد من عدم وجود قطرات يتم الاحتفاظ بها على نصائح الاستغناء أثناء الاستغناء. أيضا التحقق من أن الرأس مرتفع بما يكفي للسماح بتشريد الرأس بعد الاستغناء عن كل صف.
لتوليد قوائم اختيار لدفع ADE الاستغناء، تم تطوير ماكرو جدول بيانات سهل الاستخدام لإدارة كميات الحمض النووي وخلط ما يصل إلى أربعة plasmids في شكل لوحة 384 جيدا. يتم ملء وحدات التخزين المثلى مسبقًا في بعض خلايا جدول البيانات، ولكن يمكن تغييرها. في الحقول الوردية، يتم تعيين كاشف transfection، أو قيمة خليط TR، إلى 500 نانولترات.
يتم تعيين الحد الأدنى من قيمة حجم في آبار لوحة المصدر إلى أربعة ميكروليتر، وحجم الحد الأقصى في آبار لوحة المصدر إلى 11.25 ميكرولترات. أدخل 100 نانوغرام لكل dna microliter بدء التركيزات في الحقول الزرقاء المقابلة للحمض النووي الكامنة. ثم أدخل كمية الحمض النووي المطلوبة في الحقول الرمادية والأخضر المقابلة ل384 بئرا من لوحة.
أدخل المبالغ وأسماء البلازميد وتأكد من استخدام نفس الهجاء إذا كان يجب أن يتم نقل نفس البلازميد في عدة آبار. انقر فوق إنشاء قوائم اختيار للتحقق من القيم المدخلة، وإذا طلب ذلك، قم بتصحيح الخلايا المليئة باللون البرتقالي والتي تشير إلى أخطاء أو وحدات تخزين لا يمكن معالجتها بواسطة NanoDispenser. إذا لم يتم الكشف عن أي، فإن الماكرو توليد 384 جيدا الاستغناء الدليل، وملف اختيار الحمض النووي، وملف قائمة اختيار TR من البيانات التي تم جمعها على الأوراق المقابلة.
اطبع القالب من ورقة اللوحة المصدر لتصور الآبار التي سيتم ملؤها قبل الاستغناء. يتم الإشارة إلى أسماء plasmid وأحجام التعبئة الدنيا. يشار إلى وحدات تخزين الخليط المُكْشف المُنْتَرَض الذي سيتم ملؤه في الآبار التالية، على أنها تُرَجَّز باللون الأخضر.
لإعداد لوحة مصدر الحمض النووي، تمييع بلازميد الحمض النووي المخزن إلى 100 نانوغرام لكل ميكرولتر باستخدام الماء المقطر. الآن، معايرة شبكة 384 جيدا لأبعاد لوحة. افتح تطبيق دليل Well Pipetting 384 على جهاز لوحي.
ضع موضع المصدر على الشبكة على الشاشة السفلية. في قائمة المعايرة العلوية اليسرى، انقر فوق زائد أو ناقص لتحسين أو تقليل حجم الشبكة والآبار من أجل ضبط الآبار الخضراء إلى آبار الزاوية الأربعة للصفيح. باستخدام الشريط المزدوج من جانب، جبل 3D محول لوحة مطبوعة على الشاشة لتجنب حركات لوحة المصدر في حين الاستغناء.
إذا لزم الأمر، قم بتحريك الشبكة معايرة باستخدام الأسهم التدوير ولأعلى، أسفل، اليمين، اليسار لضبط الشبكة إلى موقف لوحة. بمجرد معايرة الشبكة وأحجام البئر وتحديد موقعها بشكل صحيح ، ضع علامة على مربع معايرة القفل. انقر على الملف وفتح 384 ويلز - Pipetting الدليل.
CSV ملف. اتبع تعليمات الشاشة لصرف يدويا حجم يشار إليه من plasmid في تركيز محدد في الأبيض جيدا تمييز يتوافق مع الوجهة المستهدفة المناسبة من لوحة المتوقعة. استخدام الأسهم ناقص أو زائد للعودة أو أبعد في عملية صرف الحمض النووي.
توقف عن الاستغناء عند الوصول إلى أول محلول كاشف نقل الحمل لتحميل. بمجرد الانتهاء من الاستغناءات الحمض النووي، وإزالة لوحة المصدر من المحول. إذا كان العديد من لوحات المصدر هي لملء، وضع لوحة مصدر جديد على المحول واتبع الإرشادات الاستغناء.
أجهزة الطرد المركزي الحمض النووي شغل لوحات المصدر لضمان التسوية السائلة السليمة وإزالة فقاعات مما يؤدي إلى عدم الدقة في نقل قاعدة ADE. الآن، قم بتشغيل استطلاع للتحكم في وحدات التخزين التي تم توزيعها يدويًا. على الكمبيوتر NanoDispenser ، تشغيل برنامج NanoDispenser.
انتقل إلى علامة التبويب التشخيص، ووضع علامة على مصدر لوحة علبة الصادر، تحميل لوحة المصدر على حامل لوحة ووضع علامة في لإدخال لوحة. عند المطالبة، حدد 384LDV_AQ_B2 لتعيين NanoDispenser إلى وضع توزيع المخزن المؤقت مائي ثم اضغط موافق. حدد الاستطلاع في القائمة المتنوعة. وانقر على الاطلاق.
حدد الآبار المعبأة مسبقا لتحليل وانقر على زر الذهاب. تحقق من أن وحدات التخزين المقاسة تتطابق مع الكميات المتوقعة، وتأكد من عدم تحميل آبار بأحجام تزيد عن 12 ميكرولتر. رئيس الأنابيب مع مصل المتوسطة الحرة عن طريق ملء وعاء معقمة جديدة مع 10 ملليلتر من مصل ما قبل الدافئة المتوسطة الحرة وغمر منظم أنبوب في ذلك.
اضغط على الزر الرئيسي لمعالج السائل الرادستي لمدة 10 ثوانٍ. تأكد من عدم انسداد طرف عن طريق فحص بصريا تدفق من رئيس الاستغناء. وضع معقمة 384 جيدا لوحة الثقافة على الناقل السائل معالج السائل، وإزالة غطاء لها.
تشغيل برنامج معايرة مسبقاً للاستغناء عن ميكرولتر واحد في كل بئر من لوحة 384 جيدا. الوقت الاستغناء حوالي ثماني ثوان. ثم استبدال غطاء من لوحة 384 جيدا.
لإعداد ADE مدفوعة صرف الحمض النووي، تشغيل برنامج قائمة الاختيار. تعيين 384 آبار مصدرها 384LDV. تعيين الجهاز إلى وضع توزيع المخزن المؤقت مائي عن طريق تحديد 384LDV_AQ_B2.
وأنواع لوحة الوجهة إلى Greiner_384PS_781096. نقل غير محسّن. حدد علامة تبويب قائمة الانتقاء.
انقر على الاستيراد. وحدد ملف DNA_Picklist_CSV. ثم، انقر فوق تشغيل وحفظ البروتوكول.
انقر على محاكاة لأداء محاكاة من الاستغناءات البرنامج للتأكد من أن قائمة الاختيار يطابق التصميم التجريبي المتوقع. انقر على زر التشغيل وبدء برنامج الاستغناء. عند سؤالك، قم بإدراج لوحة المصدر المطلوبة.
ثم لوحة الوجهة في NanoDispenser. لإعداد الاستغناء عن كاشف transfection، والعمل في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية لتخفيف مبيد الدهون transfection في مصل الدم الحرة إلى واحد x التركيز النهائي ودوامة الأنبوب. الاستغناء فورا المزيج TR وفقا للوحة مصدر محددة مسبقا deigned بواسطة الماكرو واستخدام ما قبل معايرة 384 جيدا تطبيق دليل الأنابيب.
بعد الاستغناء TR، إجراء مسح للسيطرة على وحدات التخزين المحملة TR كما فعلت من قبل للحمض النووي تحميل. حدد مزيج التفاعل transfection تعبئة مسبقة الآبار لتحليل. وانقر على زر الذهاب.
تحقق من أن وحدات التخزين المقاسة تطابق تلك المتوقعة. وضمان عدم تحميل أي آبار بأحجام تزيد عن 12 ميكرولتر. الآن قم بإعادة تعيين قائمة اختيار الحمض النووي في برنامج قائمة الاختيار.
تحقق من أن معلمات الجهاز لا تزال تعيينها إلى المخازن المؤقتة مائي. أدخل أنواع لوحات المصدر والوجهة الصحيحة. في علامة التبويب قائمة الانتقاء، انقر فوق إعادة تعيين لمسح قائمة العينات.
ثم انقر على الاستيراد واختيار TR_Picklist. CSV ملف. انقر على اللعب.
حفظ البروتوكول إذا طلب إجراء محاكاة للبرنامج transfection الاستغناءات الخليط لضمان التصميم السليم من خلال النقر على زر محاكاة. كما فعلت سابقا، بعد النقر على زر تشغيل وبدء برنامج الاستغناء مكان لوحة المصدر ومن ثم لوحة الوجهة في NanoDipsenser كما هو مطلوب. للاستغناء عن الخلايا، وملء وعاء معقمة جديدة مع تعليق الخلية المعدة وتحريكه لتجنب الترسبات مما يؤدي إلى عدم الدقة وكثافة الخلية.
أدخل منظم الأنبوب في الحل. ثم، اضغط على زر رئيس الوزراء حتى يبدأ تعليق الخلية في التدفق من رئيس الاستغناء. تأكد من أن الطرف غير مسدود عن طريق فحص بصريا تدفق من رئيس الاستغناء في حين التنظيف وضمان تحميل كل أنبوب مع تعليق الخلية.
الآن، تحميل الحمض النووي و TR شغل 384 لوحة الوجهة جيدا على الناقل لوحة معالج السائل الم Peristaltic وإزالة غطاء لها. تشغيل برنامج معايرة مسبقا للاستغناء عن 40 ميكرولترات من تعليق الخلية على لوحة كاملة 384 جيدا. الوقت الاستغناء حوالي 45 ثانية.
وأخيرا، استبدال غطاء لوحة 384 جيدا. نقل خلايا HeLa باستخدام كاشف الدهون كان ناجحا. وأظهرت كميات الحمض النووي تتراوح بين خمسة إلى 30 نانوغرام نفس الكفاءة وتصل إلى 90٪ من نقل الخلايا في حجم واحد من المراوحة الدقيقة.
وعلى النقيض من ذلك، أدت الكميات الأعلى إلى انخفاض مفاجئ في النسبة المئوية للخلايا المصابة. واختُرِبَت أحجام مختلفة من المُزلَّم تتراوح بين 15 نانويمتراً وأربعة ميكروليتر، وحُدِّد ميكرولتر واحد على أنه أفضل حالة. لزيادة تعزيز إنتاجية هذا البروتوكول تم اختبار أساليب تخزين الحمض النووي الفعالة وهما تخزين الجافة لوحة أو التخزين المجمدة.
لم تؤد طرق التخزين إلى نتائج مختلفة بشكل كبير عن محلول الحمض النووي المُوزع حديثًا المخزن لمدة تصل إلى سبعة أيام. كما تستخدم عادة البلازما transfection اثنين على الأقل من البلازميدات المختلفة، تم فحص الحمض النووي متعددة القدرة من هذا البروتوكول باستخدام أفضل الشروط التي تم تحديدها. تم تعديل tdTomato الحمراء المستخدمة سابقا البروتين الفلورسنت التعبير عن plasmid للتعبير عن mVenus مشرق البروتين الفلورسنت الأصفر وكلاهما ثم استخدمت في محاولات cotransfection.
وأظهرت الأشعة الحمراء أو الخضراء تحليل الخلايا الإيجابية الفلورسنت كفاءة transfection أن تكون حوالي 80٪ ومع ذلك، ما يقرب من 100٪ من الخلايا الحمراء كانت أيضا cotransed مع mVenus التعبير عن plasmid كما يمكن أن ينظر إليه في تحليل الصور القائم على البرمجيات التمثيلية. مرة واحدة وقد تم الاستغناء DN أن في لوحة المصدر. إجراء مسح للتأكد من أن وحدات التخزين المتوقعة قد تم تحميلها ولا تتجاوز 12 ميكرولترات.
في حين الاستغناء عن كاشف transfection في لوحة المصدر، في محاولة لتجنب فقاعات كما سوف يؤدي إلى اللوحات الفرعية الطرد المركزي في فقدان كامل لفعالية transfection. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على التجربة البيولوجية، والجرائم، وtransfection وهي مناسبة في الغالب التي يمكن أن يؤديها في شكل لوحة 384 جيدا. a transfection كامل مضادة يمهد الطريق لتطبيقات جديدة مثل plasmid مقرها المعروفة هش يلقي غير فحص النهج التي تمكن من رصد تأثير متقطعة حاليا غير قادر على أن يتم فرزها في استراتيجيات الفقراء.
