Das NanoDispenser-basierte Transfektionsprotokoll, das zur Beschreibung in diesem Video entwickelt wurde, stellt die erste benutzerfreundliche, hochdurchsatzübergreifende Methode dar, die es auch Anfängern auf diesem Gebiet ermöglicht, erfolgreich zu sein. Dies ist einfach auf High-Throughput-Technik ermöglicht die Transfektion von Zelle mit 384 unabhängigen Zustand. Ab sofort ist die Methode aufgrund des Nanovolumens des Reagenzes kostengünstig.
Um die besten Transfektionsparameter für den gesamten Zelltyp zu definieren, empfehlen wir, die DNA-Konzentration der Quelle konstant zu halten und unterschiedliche Mengen an transfizierter DNA, Transfektionsreagenz und Anzahl der Zellen zu verwenden. Für die Abgabe der 40-Mikroliter-Zellsuspension eine 10-Mikroliter-Kassette auf dem peristaltischen Flüssigkeitshandler-Gerät montieren und ein entsprechendes Programm vorbereiten. Passen Sie zunächst den Durchflussparameter auf niedrig an, um Zellen mit einer niedrigen Geschwindigkeit zu verzichten, um potenzielle Schäden an den Zellen durch schiere Belastung und hohe Auswirkungen auf den Boden der Brunnen zu vermeiden.
Passen Sie dann die Dispensationshöhe auf 11,43 Millimeter an. Die Höhe muss hoch genug sein, um den Zelleinfluss auf den Boden der Brunnen während des Dosierprozesses zu senken, aber niedrig genug, um eine Retention der Tröpfchen auf dem Dosierkopf zu vermeiden. Passen Sie als Nächstes die Plattenklarheitauflängchen auf 16 Millimeter an, um eine freie Verschiebung des Dosierkopfes über die Platte nach dem Dosieren jeder Reihe zu ermöglichen.
Steuern Sie visuell die richtigen Einstellungen der peristaltischen Flüssigkeitshandler Kopfhöhe. Stellen Sie sicher, dass während der Abgabe keine Tropfen auf den Dosierspitzen zurückgehalten werden. Überprüfen Sie auch, ob der Kopf hoch genug ist, um eine Verschiebung des Kopfes nach dem Dosieren jeder Reihe zu ermöglichen.
Um Picklists zu generieren, um die ADE-Dispensation voranzutreiben, wurde ein benutzerfreundliches Tabellenmakro entwickelt, um DNA-Mengen zu verwalten und bis zu vier Plasmide in einem 384-Well-Plattenformat zu mischen. Optimale Volumes werden in einigen Zellen der Kalkulationstabelle vorgefüllt, können jedoch geändert werden. In den rosa Feldern wird das Transfektionsreagenz oder tr-Mischwert auf 500 Nanoliter eingestellt.
Der minimale Volumenwert in den Quellplattenbrunnen wird auf vier Mikroliter und das maximale Volumen in den Quellplattenbrunnen auf 11,25 Mikroliter eingestellt. Geben Sie 100 Nanogramm pro Mikroliter DNA-Ausgangskonzentrationen in die blauen Felder ein, die der zugrunde liegenden DNA entsprechen. Geben Sie dann die gewünschte DNA-Menge in die grauen und grünen Felder ein, die den 384 Brunnen der Platte entsprechen.
Geben Sie die Mengen und Plasmidnamen ein und stellen Sie sicher, dass die gleiche Schreibweise verwendet wird, wenn dasselbe Plasmid in mehreren Brunnen transfiziert werden muss. Klicken Sie auf Auswahllisten generieren, um die eingegebenen Werte zu überprüfen, und korrigieren Sie auf Wunsch die orange gefüllten Zellen, die Fehler oder Volumes anzeigen, die vom NanoDispenser nicht verarbeitet werden können. Wenn keines erkannt wird, generiert das Makro die 384 Well-Dosieranleitung, die DNA-Auswahllistendatei und die TR-Auswahlliste-Datei aus Daten, die auf den entsprechenden Blättern gesammelt wurden.
Drucken Sie die Vorlage aus dem Quellplattenblatt, um die zu füllenden Brunnen vor dem Dosieren zu visualisieren. Plasmidnamen und minimale Füllmengen sind angegeben. Transfektionsreagenz-Mischungsvolumen, die in den folgenden Brunnen gefüllt werden, werden als TR angezeigt und grün hervorgehoben.
Um die DNA-Quellenplatte vorzubereiten, verdünnen Sie das gespeicherte DNA-Plasmid mit destilliertem Wasser auf 100 Nanogramm pro Mikroliter. Kalibrieren Sie nun das 384-Well-Raster auf die Plattenabmessungen. Öffnen Sie die 384 Well Pipetting Guide Application auf einem Tablet.
Platzieren Sie den Quellplatz auf dem Raster auf dem unteren Bildschirm. Klicken Sie im oberen linken Kalibriermenü auf Plus oder Minus, um die Größe des Gitters und der Brunnen zu verbessern oder zu verkleinern, um die grünen Brunnen an die vier Eckbrunnen der Platte anzupassen. Montieren Sie mit doppelseitigem Klebeband den 3D-gedruckten Plattenadapter auf dem Bildschirm, um Quellplattenbewegungen während der Abgabe zu vermeiden.
Verschieben Sie bei Bedarf das kalibrierte Raster mit den Rotationspfeilen und nach oben, unten, rechts, links, um das Raster an die Plattenposition anzupassen. Sobald das Raster und die Brunnengrößen richtig kalibriert und lokalisiert sind, aktivieren Sie das Sperrkalibrierungsfeld. Klicken Sie auf Datei und öffnen Sie den 384-Wells-Pipetting-Guide.
csv-Datei. Befolgen Sie die Bildschirmanweisungen, um das angegebene Volumen des Plasmids bei der angegebenen Konzentration manuell in den weiß hervorgehobenen Brunnen zu geben, der dem richtigen Zielder der erwarteten Platte entspricht. Verwenden Sie Minus- oder Pluspfeile, um im DNA-Dosierprozess zurück oder weiter zu gehen.
Beenden Sie die Abgabe, wenn Sie die erste transfektionspflichtige Reagenzlösung zum Beladen erreichen. Sobald die DNA-Dosierungen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Quellplatte aus dem Adapter. Wenn mehrere Quellplatten gefüllt werden sollen, legen Sie eine neue Quellplatte auf den Adapter und folgen Sie den Dosieranweisungen.
Zentrifugieren Sie die DNA-gefüllten Quellenplatten, um eine ordnungsgemäße Flüssigkeitsnivellierung zu gewährleisten und Blasen zu entfernen, die zu Ungenauigkeiten bei den ADE-Basisübertragungen führen. Führen Sie nun eine Umfrage durch, um die manuell ausgegebenen Volumes zu steuern. Führen Sie auf dem NanoDispenser-PC das NanoDispenser-Programm aus.
Gehen Sie zur Diagnose-Registerkarte, kreuzen Sie den Ausgangsschild-Ausgang an, laden Sie die Quellplatte auf den Plattenhalter und ticken Sie ein, um die Platte einzugeben. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie 384LDV_AQ_B2, um den NanoDispenser auf den wässrigen Pufferausgabemodus einzustellen, und drücken Sie OK. Wählen Sie Umfrage im Menü "Verschiedenes" aus. Und klicken Sie auf Start.
Wählen Sie die vorgefüllten Brunnen aus, um sie zu analysieren, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Gehen". Stellen Sie sicher, dass die gemessenen Volumina mit den erwarteten volumen übereinstimmen, und stellen Sie sicher, dass keine Brunnen mit Volumen von mehr als 12 Mikrolitern beladen wurden. Den Schlauch mit serumfreiem Medium grundieren, indem Sie ein neues steriles Gefäß mit 10 Millilitern vorgewärmtem Serum-freien Medium füllen und den Röhrenorganisator darin untertauchen.
Drücken Sie die Prime-Taste des peristaltischen Flüssigkeitshandlers für ca. 10 Sekunden. Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht verstopft ist, indem Sie den Fluss vom Dosierkopf visuell überprüfen. Legen Sie eine sterile 384 Brunnenkulturplatte auf den peristaltischen Flüssigkeitshandler-Plattenträger und entfernen Sie ihren Deckel.
Führen Sie das vorkalibrierte Programm aus, um in jedem Brunnen der 384-Well-Platte einen Mikroliter auszugeben. Die Dosierzeit beträgt ca. acht Sekunden. Dann den Deckel der 384 WellPlatte austauschen.
Um ADE-gesteuerte DNA-Dosierung einzurichten, führen Sie die Picklist-Software aus. Stellen Sie die 384 Brunnen aus der Quelle auf 384LDV. Legen Sie das Gerät auf den wässrigen Pufferdosiermodus fest, indem Sie 384LDV_AQ_B2 auswählen.
Und die Zielplattentypen zu Greiner_384PS_781096. Nicht tickoptimierter Übertragungsdurchsatz. Wählen Sie die Registerkarte "Auswahlliste" aus.
Klicken Sie auf Import. Wählen Sie die DNA_Picklist_CSV-Datei aus. Klicken Sie dann auf Spielen und speichern Sie das Protokoll.
Klicken Sie auf Simulieren, um eine Simulation der Programmdispensationen durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Auswahlliste dem erwarteten experimentellen Entwurf entspricht. Klicken Sie auf die Run-Taste und starten Sie das Dosierprogramm. Legen Sie auf Anfrage die gewünschte Quellplatte ein.
Und dann die Zielplatte im NanoDispenser. Um die Transfektionsreagenzdispensation einzurichten, arbeiten Sie in einem Biosicherheitsschrank, um lipopolyplextransfektionsreagenz in serumfreiem Medium auf eine ein x endliche Konzentration zu verdünnen und das Rohr zu wirbeln. Geben Sie den TR-Mix sofort entsprechend der vordefinierten Quellplatte, die vom Makro deigned wird, und verwenden Sie die vorkalibrierte 384 Well Pipettierführung.
Führen Sie nach der TR-Dosierung eine Umfrage durch, um die TR-geladenen Volumina wie zuvor für die geladene DNA zu steuern. Wählen Sie den zu analysierenden Transfektionsreaktionsmix vorgefüllte Brunnen aus. Und klicken Sie auf den Go-Button.
Stellen Sie sicher, dass die gemessenen Volumes mit den erwarteten übereinstimmen. Und stellen Sie sicher, dass keine Brunnen mit Volumen von mehr als 12 Mikrolitern beladen wurden. Führen Sie nun einen Reset der DNA-Auswahlliste in der Auswahllistensoftware durch.
Stellen Sie sicher, dass die Geräteparameter weiterhin auf wässrige Puffer festgelegt sind. Geben Sie die richtigen Quell- und Zielplattentypen ein. Klicken Sie auf der Registerkarte "Auswahlliste" auf Zurücksetzen, um die Beispielliste zu löschen.
Klicken Sie dann auf Importieren und wählen Sie die TR_Picklist. CSV-Datei. Klicken Sie auf play.
Speichern Sie das Protokoll, wenn Sie dazu aufgefordert werden, und führen Sie eine Simulation der Programmtransfektionsreagenz-Mischungsdosierungen durch, um ein korrektes Design zu gewährleisten, indem Sie auf die Schaltfläche "Simulieren" klicken. Wie zuvor, nach dem Klicken auf die Run-Taste und starten des Dosierprogramms platzieren Sie die Quellplatte und dann die Zielplatte in der NanoDipsenser wie gewünscht. Um die Zellen zu verteilen, füllen Sie ein neues steriles Gefäß mit der vorbereiteten Zellsuspension und rühren Sie es, um Sedimentationen zu vermeiden, die zu Ungenauigkeitund Zelldichte führen.
Fügen Sie den Rohrorganisator in die Lösung ein. Drücken Sie dann die Prime-Taste, bis die Zellsuspension vom Dosierkopf zu spülen beginnt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht verstopft ist, indem Sie den Fluss vom Dosierkopf während der Spülung visuell überprüfen und sicherstellen, dass jedes Rohr mit Zellsuspension beladen ist.
Laden Sie nun die DNA und TR gefüllt 384 gut Zielplatte auf die peristaltic Flüssigkeit Handler Plattenträger und entfernen Sie seinen Deckel. Führen Sie das vorkalibrierte Programm aus, um 40 Mikroliter der Zellsuspension auf die komplette 384-Well-Platte zu verteilen. Die Dosierzeit beträgt ca. 45 Sekunden.
Schließlich ersetzen Sie den Deckel der 384 Well Platte. Die Transfektion von HeLa-Zellen mit Lipopolyplexer Reagenz war erfolgreich. DNA-Mengen zwischen fünf und 30 Nanogramm zeigten die gleiche Effizienz und bis zu 90% Zelltransfektion bei einem Mikroliter-Verdünnungsvolumen.
Im Gegensatz dazu führten höhere Mengen zu einer abrupten Abnahme des Prozentsatzes der transfizierten Zellen. Verschiedene Verdünnungsvolumina von 15 Nanolitern bis zu vier Mikrolitern wurden getestet und ein Mikroliter als bester Zustand identifiziert. Um den Durchsatz dieses Protokolls weiter zu verbessern, wurden zwei effiziente DNA-Speichermethoden getestet, nämlich die Trockenlagerung der Platte oder die tiefgefrorene Lagerung.
Beide Speichermethoden führten nicht zu signifikant unterschiedlichen Ergebnissen als frisch dosierte DNA-Lösungen, die bis zu sieben Tage gelagert wurden. Da die Plasmatransfektion in der Regel mindestens zwei verschiedene Plasmide verwendet, wurde die DNA-Multiplexing-Fähigkeit dieses Protokolls unter Verwendung der besten identifizierten Bedingungen untersucht. Das zuvor verwendete tdTomato rote fluoreszierende Protein, das Plasmid exprimiert, wurde modifiziert, um mVenus ein hellgelbes fluoreszierendes Protein auszudrücken, und beide wurden dann bei Kotransfektionsversuchen verwendet.
Rote oder grüne fluoreszierende positive Zellanalyse zeigte die Transfektionseffizienz etwa 80%Allerdings wurden fast 100% der roten Zellen auch mit dem mVenus exezierenden Plasmid kotransfiziert, wie in der repräsentativen softwarebasierten Bildanalyse zu sehen ist. Sobald DNAs in der Quellplatte abgegeben wurden. Führen Sie eine Umfrage durch, um sicherzustellen, dass die erwarteten Volumes geladen wurden und 12 Mikroliter nicht überschreiten.
Während der Abgabe des Transfektionsreagenzes in der Quellplatte, versuchen Sie, Blasen zu vermeiden, da zentrifugierende Unterplatten zu einem vollständigen Verlust der Transfektion Wirksamkeit führen. Diese Methode kann auf biologische Experimente, Verbrechen und Transfektion angewendet werden und eignet sich für die meisten, die in einem 384 Well-Platten-Format durchgeführt werden können. Eine vollfeste Transfektion ebnet den Weg für neue Anwendungen wie Plasmid, das für knackigere Nicht-Screening-Ansätze bekannt ist und die Überwachung intermittierender Affekte ermöglicht, die derzeit nicht in schlechten Strategien sortiert werden können.
