このビデオで説明するために開発されたNanoDispenserベースのトランスフェクションプロトコルは、初めてのユーザーフレンドリーで高スループットのトランスフェクション方式を表し、現場の初心者でも成功を収めることを可能にします。これは384の独立した条件の細胞のトランスフェクションを可能にするハイスループットの技術で容易である。現在のところ、この方法は、必要な試薬のナノ量に起因する低コストです。
すべての細胞タイプに最適なトランスフェクションパラメータを定義するために、ソースDNA濃度を一定に保ち、様々な量のトランスフェクションDNA、トランスフェクション試薬、および細胞数を使用することをお勧めします。40マイクロリットルのセル懸濁液を分配するために、蠕動性液体ハンドラ装置に10マイクロリットルカセットを取り付け、適切なプログラムを準備する。まず、流量パラメータを低に調整して、細胞の低速度を分配し、完全なストレスとウェルの底部への高い影響によって細胞への潜在的な損傷を促進しないようにします。
その後、分配の高さを11.43ミリメートルに調整します。高さは、分配プロセス中にウェルの底部に対する細胞の影響を下げるほど高くなければならないが、分配ヘッドの液滴の保持を避けるのに十分低い。次に、プレートのクリア高さを16ミリメートルに調整し、各列を分配した後に分配ヘッドの自由な変位をプレート上に置きます。
蠕動性液体ハンドラヘッド高の適切な設定を視覚的に制御します。分配の間に分配の先端に滴が保持されないです。また、各行を分配した後にヘッドの変位を可能にするのに十分な高さであることを確認してください。
ADEディスペンスを駆動するための選択リストを生成するために、DNA量を管理し、384ウェルプレート形式で最大4つのプラスミドを混合するためのユーザーフレンドリーなスプレッドシートマクロが開発されました。最適なボリュームはスプレッドシートの一部のセルに事前入力されていますが、変更できます。ピンクの分野では、トランスフェクション試薬、またはTR混合物値が500ナノリットルに設定されている。
ソースプレートウェルの最小体積値は4マイクロリットルに設定され、ソースプレートウェルの最大体積は11.25マイクロリットルに設定されます。基礎となるDNAに対応する青いフィールドに、マイクロリットルDNA開始濃度あたり100ナノグラムを入力します。次に、プレートの384ウェルに対応するグレーおよび緑色のフィールドに所望のDNA量を入力する。
量とプラスミド名を入力し、同じプラスミドがいくつかの井戸にトランスフェクションする必要がある場合は、同じスペルが使用されていることを確認します。入力された値を確認するために選択リストを生成する をクリックし、要求された場合は、NanoDispenser で処理できないエラーまたはボリュームを示すオレンジ色の塗り潰しセルを修正します。何も検出されない場合、マクロは、対応するシート上で収集されたデータから384ウェルディスペンスガイド、DNA選択リストファイル、およびTR選択リストファイルを生成します。
ソースプレートシートからテンプレートを印刷して、分配する前に充填するウェルを視覚化します。プラスミド名と最小充填量が示されます。トランスフェクション試薬混合物容積は、以下のウェルに充填され、TRとして示され、緑色で強調表示される。
DNAソースプレートを調製するには、蒸留水を用いて保存されたDNAプラスミドを1マイクロリットル当たり100ナノグラムに希釈する。さて、プレート寸法に384ウェルグリッドをキャリブレーションします。タブレット上の384ウェルピペットガイドアプリケーションを開きます。
ソースを下の画面のグリッド上に配置します。左上の調整メニューで、プラスまたはマイナスをクリックして、プレートの 4 つのコーナーウェルにグリーンウェルを調整するために、グリッドとウェルのサイズを増減します。両面テープを使用して、3Dプリントされたプレートアダプタを画面に取り付け、分配中にソースプレートの動きを避けます。
必要に応じて、回転矢印を使用して、グリッドを上下左右のボタンを使用して、グリッドをプレートの位置に調整します。グリッドとウェルサイズが適切に調整され、配置されたら、ロックキャリブレーションボックスにチェックを入れます。ファイルをクリックして、384-ウェルズピペットガイドを開きます。
csv ファイル。画面の指示に従って、指定された濃度のプラスミドの示された体積を、期待されるプレートの適切なターゲット先に対応する白い強調表示ウェルに手動で分配します。DNAの分配プロセスに戻るか、またはさらに進むために、マイナスまたはプラス矢印を使用してください。
最初のトランスフェクション試薬溶液に到達すると、分配を停止します。DNAの分配が終わったら、アダプターからソースプレートを取り外します。複数のソースプレートを充填する場合は、アダプタに新しいソースプレートを置き、塗布指示に従います。
適切な液体のレベリングを確保し、ADEベース転送の不正確さにつながる気泡を除去するために、DNA充填ソースプレートを遠心分離します。次に、調査を実行して、手動で分配されたボリュームを制御します。ナノディスペンサーPCで、ナノディスペンサープログラムを実行します。
診断タブに移動し、ソースプレートのアウトボックスにチェックを入れ、プレートホルダーにソースプレートをロードし、プレートに入るためにチェックを入れます。プロンプトが表示されたら、384LDV_AQ_B2選択してNanoDispenserを水性バッファディスペンスモードに設定し、[OK]を押します。その他のメニューでアンケートを選択します。そして、起動をクリックします。
分析する事前に充填されたウェルを選択し、移動ボタンをクリックします。測定されたボリュームが期待したボリュームと一致することを確認し、12マイクロリットル以上のボリュームで井戸がロードされていないことを確認します。新しい無菌容器に10ミリリットルのプレウォームドセラムフリー培地を充填し、チューブオーガナイザーを水没させることで、無血清培地でチューブをプライムします。
蠕動性液体ハンドラの素本ボタンを約10秒間押します。分配ヘッドからの流れを目視で点検して、先端が詰まっていることを確認してください。滅菌384ウェル培養プレートを蠕動性液体ハンドラプレートキャリアに置き、蓋を取り外します。
384ウェルプレートの各ウェルに1マイクロリットルを分配するために、事前校正されたプログラムを実行します。分配時間はおよそ8秒である。その後、384ウェルプレートの蓋を交換してください。
ADE 駆動 DNA ディスペンスを設定するには、選択リスト ソフトウェアを実行します。384 ウェルを 384LDV に設定します。384LDV_AQ_B2を選択して、デバイスを水性バッファー塗布モードに設定します。
そして、Greiner_384PS_781096するデスティネーションプレートタイプ。ティックを解除して最適化された転送スループットをオフにします。選択リスト タブを選択します。
インポートをクリックします。DNA_Picklist_CSVファイルを選択します。次に、再生をクリックしてプロトコルを保存します。
[シミュレーション]をクリックしてプログラムディスペンスのシミュレーションを実行し、選択リストが予想される実験計画と一致することを確認します。実行ボタンをクリックして、塗布プログラムを開始します。要求されたら、要求されたソース プレートを挿入します。
そして、ナノディスペンサーの目的地プレート。トランスフェクション試薬の塗布をセットアップするには、バイオセーフティキャビネットで、無血清培地でリポポリプレックストランスフェクション試薬を1 x最終濃度に希釈し、チューブをボルテックスします。すぐにマクロによって有される事前に定義されたソースプレートに従ってTRの混合物を分配し、事前に校正された384井戸ピペットガイドアプリケーションを使用して。
TRディスペンスに続いて、ロードされたDNAに対して以前に行われたようにTRロードされたボリュームを制御するための調査を行います。分析するトランスフェクション反応ミックスプレフィルドウェルを選択します。そして、移動ボタンをクリックします。
測定されたボリュームが期待したボリュームと一致することを確認します。そして、井戸が12マイクロリットル以上のボリュームでロードされていないことを確認してください。選択リストソフトウェアでDNA選択リストのリセットを実行します。
デバイス パラメータが、依然として水性バッファに設定されていることを確認します。正しいソースプレートと宛先プレートタイプを入力します。選択リストタブで、リセットをクリックしてサンプルリストをクリアします。
次に、インポートをクリックして、TR_Picklistを選択します。CSV ファイル。再生をクリックします。
プロンプトが表示されたらプロトコルを保存し、プログラムトランスフェクション試薬の混合剤のディザレーションのシミュレーションを実行して、シミュレーションボタンをクリックして適切な設計を保証します。前に行われたように、実行ボタンをクリックして、塗布プログラムを開始した後、要求に応じて、ソースプレートと、NanoDipsenserの宛先プレートを配置します。細胞を分配するには、新しい無菌容器に調製された細胞懸濁液を充填し、不正確さと細胞密度につながる沈下を避けるためにそれを攪拌する。
ソリューションにチューブ オーガナイザーを挿入します。次に、セル懸濁液が分配ヘッドからフラッシュし始めるまでプライムボタンを押します。フラッシュ中に分配ヘッドからの流れを視覚的に検査して先端が詰まっていることを確認し、各チューブにセルサスペンションが積み込まれているようにしてください。
今度は、蠕動性液体ハンドラプレートキャリアにDNAおよびTR充填384ウェル先送りプレートをロードし、その蓋を取り外します。完全な384ウェルプレート上の細胞懸濁液の40マイクロリットルを分配するために事前校正されたプログラムを実行します。分配の時間は約45秒である。
最後に、384ウェルプレートの蓋を交換します。リポポリプレックス試薬を用いたHeLa細胞のトランスフェクションが成功した。5~30ナノグラムのDNA量は、1マイクロリットルの希釈体積で同じ効率と最大90%の細胞トランスフェクションを示した。
対照的に、高い量は、トランスフェクトされた細胞の割合の急激な減少をもたらした。15ナノリットルから4マイクロリットルまでの様々な希釈液量を試験し、1マイクロリットルが最良の条件として同定された。このプロトコルのスループットをさらに高めるために、2つの効率的なDNA保存方法は、すなわちプレートまたは凍結貯蔵を乾燥して保存して試験した。
両方の保存方法は、最大7日間保存された新しい分注されたDNA溶液とは有意に異なる結果を導かなかった。血漿トランスフェクションは通常、少なくとも2つの異なるプラスミドを採用するので、このプロトコルのDNA多重化能を、最良の同定された条件を用いて検討した。以前に使用したtdTomato赤色蛍光タンパク質をプラスミドを発現させ、mVenusを明るい黄色の蛍光タンパク質を発現するように改変し、その後、両方をコトランスフェクションの試みに使用した。
赤色または緑色蛍光陽性細胞分析はトランスフェクション効率が約80%であることを示したが、代表的なソフトウェアベースの画像分析で見られるように、赤細胞のほぼ100%がプラスミドを発現するmVenusと共感染した。一度DNAがソースプレートに分配されました。予想されるボリュームがロードされ、12マイクロリットルを超えないように調査を実行します。
ソースプレートにトランスフェクション試薬を塗布しながら、遠心サブプレートがトランスフェクション効果の完全な損失をもたらすので、気泡を避けるようにしてください。この方法は、生物実験、犯罪、およびトランスフェクションに適用することができ、384ウェルプレート形式で行うことができる大部分に適しています。フルプルーフトランスフェクションは、クリスピーキャスト非スクリーニングアプローチで知られるプラスミドベースなどの新しいアプリケーションへの道を開き、現在貧弱な戦略でソートすることができない断続的な影響の監視を可能にします。
