이 비디오에서 설명하기 위해 개발된 Nano 없어서스터 기반 의정서는 현장에서 초보자도 성공할 수 있도록 하는 최초의 사용자 친화적이고 높은 처리량 트랜스페션 방법을 나타냅니다. 이것은 384 개의 독립적 인 조건으로 셀의 전이를 전환 할 수있는 높은 처리량 기법에 쉽습니다. 현재, 이 방법은 필요한 시약의 나노 부피로 인해 비용이 낮다.
모든 세포 유형에 대한 최상의 경질 파라미터를 정의하기 위해 소스 DNA 농도를 일정하게 유지하고 다양한 양의 전이 DNA, 트랜스페션 시약 및 세포 수를 사용하는 것이 좋습니다. 40 마이크로리터 셀 서스펜션을 분배하기 위해 연동 액체 처리기 장치에 10 마이크로리터 카세트를 장착하고 적절한 프로그램을 준비합니다. 첫째, 유량 파라미터를 낮은 속도로 조정하여 낮은 속도로 세포를 분배하여 순수한 응력과 우물 바닥에 높은 충격으로 세포에 대한 잠재적 손상을 촉진하지 않도록 한다.
그런 다음 경륜경 높이를 11.43밀리미터로 조정합니다. 신장은 분배 과정에서 우물 바닥에 세포 충격을 낮출 만큼 충분히 높어야하지만, 디스펜싱 헤드에 액적의 보존을 피하기에 충분히 낮습니다. 다음으로, 플레이트 클리어 높이를 16mm로 조정하여 각 행을 분배한 후 디스펜싱 헤드의 자유로운 변위를 플레이트 위로 자유롭게 변위를 할 수 있도록 합니다.
연동 액체 처리기 헤드 높이의 적절한 설정을 시각적으로 제어합니다. 디스펜싱 하는 동안 디스펜싱 팁에 드롭이 유지되지 않았는지 확인하십시오. 또한 각 행을 분배한 후 헤드의 변위를 허용할 만큼 머리가 충분히 높은지 확인합니다.
ADE 경륜을 구동하기 위해 선택 목록을 생성하기 위해 사용자 친화적 인 스프레드 시트 매크로가 개발되어 DNA 양을 관리하고 384 개의 웰 플레이트 형식으로 최대 4 개의 플라스미드를 혼합했습니다. 최적의 볼륨은 스프레드시트의 일부 셀에서 미리 채워지지만 변경할 수 있습니다. 분홍색 분야에서, 경질 시약, 또는 TR 혼합물 값은 500 나노리터로 설정된다.
소스 플레이트 웰의 최소 부피 값은 4개의 마이크로리터로 설정되며 소스 플레이트의 최대 부피는 11.25 마이크로리터로 잘 설정됩니다. 기본 DNA에 대응하는 파란색 필드에 있는 마이크로리터 DNA 시작 농도당 100 나노그램을 입력합니다. 이어서, 플레이트의 384웰에 대응하는 회색 및 녹색 필드에 원하는 DNA 양을 입력한다.
양과 플라스미드 이름을 입력하고 동일한 플라스미드가 여러 우물에서 전염되어야 하는 경우 동일한 철자가 사용되는지 확인합니다. 입력된 값을 확인하기 위해 선택 목록을 생성하려면 클릭하고 요청하면 Nano 없어서더러가 처리할 수 없는 오류 또는 볼륨을 나타내는 주황색 으로 채워진 셀을 수정합니다. 아무 것도 감지되지 않으면 매크로는 해당 시트에 수집된 데이터에서 384 웰 디스펜싱 가이드, DNA 선택 목록 파일 및 TR 픽리스트 파일을 생성합니다.
소스 플레이트 시트에서 템플릿을 인쇄하여 분배하기 전에 채워질 우물을 시각화합니다. 플라스미드 이름과 최소 채우기 볼륨이 표시됩니다. 다음 우물에서 채워질 경질 시약 혼합물 부피는 TR으로 표시되고 녹색으로 강조 표시됩니다.
DNA 소스 플레이트를 준비하려면 증류수를 사용하여 마이크로리터 당 저장된 DNA 플라스미드를 100 나노그램으로 희석합니다. 이제 384 웰 그리드를 플레이트 치수로 보정합니다. 태블릿에서 384 웰 파이펫팅 가이드 응용 프로그램을 엽니다.
소스 위치를 아래쪽 화면의 그리드에 배치합니다. 왼쪽 상단 교정 메뉴에서 플러스 또는 마이너스를 클릭하여 그리드와 우물의 크기를 향상하거나 줄여 녹색 우물을 플레이트의 4개의 모서리 우물로 조정합니다. 양면 테이프를 사용하여 디스펜싱 하는 동안 소스 플레이트 움직임을 피하기 위해 화면에 3D 인쇄 플레이트 어댑터를 장착합니다.
필요한 경우 회전 화살표를 사용하여 보정된 그리드를 위, 아래, 오른쪽, 왼쪽 버튼을 이동하여 그리드를 플레이트 위치로 조정합니다. 그리드와 웰 사이즈가 제대로 보정되고 위치하면 잠금 보정 상자를 선택합니다. 파일을 클릭하고 384-웰스-파이펫팅 가이드를 엽니다.
csv 파일입니다. 화면 지침을 따라 지정된 농도에서 플라스미드의 표시된 볼륨을 예상 플레이트의 적절한 대상에 해당하는 흰색 강조 표시 우물에 수동으로 분배합니다. DNA 분배 과정에서 마이너스 또는 플러스 화살표를 사용하여 돌아가거나 더 멀리 이동하십시오.
로드할 첫 번째 경질 시약 솔루션에 도달하면 디스펜싱을 중지합니다. DNA 경륜의 시대가 끝나면 어댑터에서 소스 플레이트를 제거합니다. 여러 소스 플레이트를 채우려면 어댑터에 새 소스 플레이트를 배치하고 디스펜싱 지침을 따릅니다.
DNA 채워진 소스 플레이트를 원심분리하여 적절한 액체 수평을 보장하고 ADE 베이스 전송의 부정확성으로 이어지는 거품을 제거합니다. 이제 설문조사를 실행하여 수동으로 분배된 볼륨을 제어합니다. 나노 디스펜더 PC에서 나노 디스펜더 프로그램을 실행합니다.
진단 탭으로 이동, 소스 플레이트 아웃박스를 체크, 플레이트 홀더에 소스 플레이트를로드하고 접시를 입력에 진드기. 메시지가 표시되면 384LDV_AQ_B2 선택하여 Nano Dispenser를 수성 버퍼 디스펜싱 모드로 설정하고 확인을 누릅니다. 기타 메뉴에서 설문조사를 선택합니다. 그리고 출시를 클릭합니다.
미리 채워진 우물을 선택하여 이동 버튼을 분석하고 클릭합니다. 측정된 볼륨이 예상 볼륨과 일치하는지 확인하고 12개 이상의 마이크로리터의 부피가 적재되지 않았는지 확인합니다. 사전 데워진 세럼 프리 배지10밀리리터로 새로운 멸균 용기와 튜브 를 장착하여 튜브를 프리 배지로 준비하십시오.
연동 액체 처리기의 주요 버튼을 약 10초 간 누릅니다. 디스펜싱 헤드의 흐름을 시각적으로 검사하여 팁이 막히지 않았는지 확인합니다. 연동 액체 처리기 플레이트 캐리어에 멸균 384 웰 배양 플레이트를 놓고 뚜껑을 제거합니다.
미리 보정된 프로그램을 실행하여 384 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 마이크로리터를 분배합니다. 분배 시간은 약 8초입니다. 그런 다음 384 웰 플레이트의 뚜껑을 교체하십시오.
ADE 구동 DNA 디스펜싱을 설정하려면 선택 목록 소프트웨어를 실행합니다. 384LDV로 공급되는 384개의 우물을 설정합니다. 384LDV_AQ_B2 선택하여 장치를 수성 버퍼 디스펜싱 모드로 설정합니다.
그리고 대상 플레이트 유형은 Greiner_384PS_781096. 언틱 최적화 된 전송 처리량. 목록 선택 탭을 선택합니다.
가져오기를 클릭합니다. 그리고 DNA_Picklist_CSV 파일을 선택합니다. 그런 다음 재생을 클릭하고 프로토콜을 저장합니다.
시뮬레이션을 클릭하여 프로그램 경륜의 시뮬레이션을 수행하여 선택 목록이 예상실험 설계와 일치하는지 확인합니다. 실행 버튼을 클릭하고 디스펜싱 프로그램을 시작합니다. 요청된 소스 플레이트를 삽입합니다.
그리고 나노 디스펜더의 대상 플레이트. 경질 시약 경륜경을 설정하려면 생물 안전 캐비닛에서 작업하여 혈청 프리 배지에서 리포폴리플렉스 트랜스펙트 시약을 1x 최종 농도로 희석하고 튜브를 소용돌이시다. 매크로에 의해 품위를 매여 미리 보정된 384웰 파이펫팅 가이드 응용을 사용하여 미리 정의된 소스 플레이트에 따라 TR 믹스를 즉시 분배한다.
TR 디스펜싱 후, 로드된 DNA에 대해 이전과 마찬가지로 TR로드 볼륨을 제어하는 설문 조사를 수행합니다. 분석하기 위해 미리 채워진 우물을 선택합니다. 그리고 이동 버튼을 클릭합니다.
측정된 볼륨이 예상 볼륨과 일치하는지 확인합니다. 또한 12개 이상의 마이크로리터의 부피가 적재되지 않았는지 확인합니다. 이제 선택 목록 소프트웨어에서 DNA 선택 목록의 리셋을 수행합니다.
장치 매개 변수가 여전히 수중 버퍼로 설정되어 있는지 확인합니다. 올바른 소스 및 대상 플레이트 유형을 입력합니다. 선택 목록 탭에서 재설정을 클릭하여 샘플 목록을 지웁웁다.
그런 다음 가져오기를 클릭하고 TR_Picklist 선택합니다. CSV 파일입니다. 재생을 클릭합니다.
프로토콜을 묻는 메시지가 표시되고 프로그램 트랜스페션 시약 혼합물 경륜의 시뮬레이션을 수행하면 프로토콜을 저장하여 시뮬레이션 버튼을 클릭하여 적절한 설계를 보장합니다. 앞서 수행한 것처럼 실행 버튼을 클릭하고 디스펜싱 프로그램을 시작한 후 소스 플레이트와 요청대로 NanoDipsenser의 대상 플레이트를 배치합니다. 세포를 분배하려면, 준비된 세포 현탁액으로 새로운 멸균 용기를 채우고 침전을 피하기 위해 교반하여 부정확성과 세포 밀도로 이어집니다.
솔루션에 튜브 오거나이저를 삽입합니다. 그런 다음 셀 서스펜션이 디스펜싱 헤드에서 플러시되기 시작할 때까지 프라임 버튼을 누릅니다. 홍조하는 동안 디스펜싱 헤드의 흐름을 시각적으로 검사하여 팁이 막히지 않았는지 확인하고 각 튜브에 셀 서스펜션이 로드되었는지 확인합니다.
이제, 연동 액체 처리기 플레이트 캐리어에 DNA와 TR 충전 384 잘 대상 플레이트를로드하고 뚜껑을 제거합니다. 사전 보정된 프로그램을 실행하여 전체 384 웰 플레이트에서 셀 서스펜션의 40 마이크로리터를 분배합니다. 분배 시간은 약 45초입니다.
마지막으로, 384 웰 플레이트의 뚜껑을 교체하십시오. 리포폴리플렉스 시약을 사용하여 HeLa 세포의 질피는 성공적이었습니다. 5~30나노그램에 이르는 DNA 양은 하나의 마이크로리터 희석제부에서 동일한 효율과 최대 90%의 세포 형광을 보였다.
대조적으로, 더 높은 양은 전감염된 세포의 비율에 있는 급격한 감소 귀착되었습니다. 15 나노리터에서 4개의 마이크로리터에 이르는 다양한 희석제 부피가 테스트되었고 1개의 마이크로리터가 최상의 조건으로 확인되었다. 이 프로토콜의 처리량을 더욱 향상시키기 위해 두 가지 효율적인 DNA 저장 방법은 플레이트 또는 냉동 저장을 건조하게 저장하는 것을 테스트했습니다.
두 저장 방법 모두 최대 7일 동안 저장된 갓 분배된 DNA 용액과는 크게 다른 결과를 초래하지 않았다. 혈장 이식은 일반적으로 적어도 2개의 다른 플라스미드를 채택하기 때문에, 이 프로토콜의 DNA 멀티플렉싱 능력은 가장 잘 확인된 조건을 사용하여 검토되었다. 이전에 사용 된 tdTomato 적색 형광 단백질 플라스미드를 발현하는 것은 mVenus 밝은 노란색 형광 단백질을 표현하도록 변형되었으며 둘 다 응고 시도에서 사용되었습니다.
적색 또는 녹색 형광 양성 세포 분석은 약 80%가 되는 경전 효율을 보였지만, 적혈구의 거의 100%는 대표적인 소프트웨어 기반 이미지 분석에서 볼 수 있는 바와 같이 플라스미드를 발현하는 mVenus와 도금처리되어 있었다. 일단 DNA가 소스 플레이트에 분배되었습니다. 예상 볼륨이 로드되고 12마이크로리터를 초과하지 않도록 설문조사를 수행합니다.
소스 플레이트에서 경전 시약을 분배하는 동안 원심 분리 서브 플레이트가 완전한 트랜스페션 효능을 상실할 수 있기 때문에 거품을 피하십시오. 이 방법은 생물학적 실험, 범죄 및 경질에 적용될 수 있으며 대부분 384웰 플레이트 형식으로 수행될 수 있는 데 적합합니다. 완전한 교정 형질은 현재 가난한 전략으로 정렬 할 수없는 간헐적 인 영향을 모니터링 할 수 있도록 선명한 캐스트 비 스크리닝 접근 법으로 알려진 플라스미드 기반과 같은 새로운 응용 프로그램에 대한 길을 열어줍니다.
