الهدف العام لهذه التجربة، لدينا نموذج نقص التروية hindlimb هو ضوء التجربة أساسا لتقييم شامل للآثار الوظيفية، والهسولوج والجزيئية من وكلاء أوعية أوعية مُتَقَلِّفة. يتناول هذا البروتوكول معيارًا لاختبار العلاجات الممكنة في أوعية حيوانية صغيرة مع إمكانية تطبيقات مستقبلية في السياق السريري. كما إعادة الأوعية الدموية ليست مناسبة في عشرين إلى ثلاثين في المئة من مرضى نقص التروية الحرجة ظهرت الأوعية العلاجية كاستراتيجية جديدة لتحسين وفرة الدم في موقع الإقفاري.
يمكن أن يوفر هذا البروتوكول التجريبي فهمًا شاملًا للآليات التي تمارس بها العلاجات الوعائية آثارها في قياس فعاليتها في كل نتيجة من نتائجها. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم في 22 أسبوع من العمر C57 أسود ستة فأرة أنثى، حلق الشعر من hindlimb الحق وتأمين الحيوان في الظهر إلى موقف التكعيب على وسادة ساخنة. ضع الحيوان تحت مجهر تشريح.
واستخدم رقم واحد عشر شفرة مشرط جراحية لصنع شق جلدي سنتيمتر واحد على الفخذ الأيمن. حادة تشريح الدهون تحت الجلد لفضح حزمة الأوعية الدموية العصبية. واستخدام ملقط مدببة، مقص الربيع، وحامل إبرة العيون لفتح الغزام الغشاء الايلوفيموري لفضح الأوعية الحرقفية الخارجية والأوعية الفخذية.
بعد تشريح وفصل الشريان والوريد عن العصب، استخدم خياطة البولي بروبلين غير القابلة للابصال O لصبغ الشريان الفخذي والوريد والشريان الوريدي الخارجي. تحديد الشريان الحرقفي الخارجي و الربط والاستئصال من الشريان الحرقفي الخارجي والأوردة الخارجية هي حاسمة لنجاح العملية. استخدم مقص الربيع لتنقّل الجزء من الشريان الوريدي والأوردة بين العقدة البعيدة والقريبة.
و أغلق الشق بخياطة قابلة للامتصاص ثم، بين البريتوني تسليم حل مضاد للزب في الحيوان والعودة الماوس إلى قفصها المنزل مع رصد حتى الشفاء الكامل. لحصاد عضلات المعدة، قم بإزالة الجلد من كلا الـ hindlimbs.
واستخدم مسحة القطن لفصل الجلد عن العضلات. عقد وتر أخيل، واستخدام مقص الربيع لفصل العضلات من الساق والشظية تصل إلى مفصل الركبة. وفصل العضلة ذات الرأسين فيرموريس عن عضلة المعدة.
استخدام مقص الربيع لقطع الإدراجات من العضلات gastrocnemius على مستوى مفصل الركبة. واستخدام 10٪ trigasanth لوضع العضلات المحصودة في اتجاه عرضية على قرص الفلين الصغيرة. ثم، المفاجئة تجميد العينات في النيتروجين السائل تبريد إيسوبنتان للتخزين ناقص 80 درجة مئوية.
لالتقاط الليزر الشعرية الصغيرة، بعد الحصول على 12 قسم ميكرومتر من العينات العضلات، وإصلاح الأنسجة إلى الشرائح في 50 ملليلتر من الأسيتون النقي المبرد لمدة خمس دقائق في ناقص عشرين درجة مئوية. بعد تجفيف الهواء ودائرة كل عينة مع قلم مبيد للماء. و اُعادت العينات بكلورين صوديوم مُضّد في برنامج تلفزيوني عند أربع درجات مئوية
في نهاية إعادة الترطيب، تسمية العينات مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تليها اثنين من ثلاث دقائق يغسل في اثنين من كلوريد الصوديوم الضرس الطازجة في PBS لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، تسمية المقاطع مع جسم مضاد الثانوية المناسبة لمدة ثلاثين دقيقة في أربع درجات مئوية تليها اثنين من يغسل في كلوريد الصوديوم في برنامج تلفزيوني كما هو موضح.
المقبل، تسمية العينات مع avidin مجمع peroxidase مترافق لمدة ثلاثين دقيقة في أربع درجات مئوية. تليها غسل وخمس دقائق من وضع العلامات مع الركيزة peroxidase DAB. في نهاية الحضانة، وتجفيف الأنسجة في الجليد البارد المتتابعة 90٪ الإيثانول و 100٪ emersions الإيثانول.
ثم، استخدام نظام microdissection في وقت لاحق، ومجهزة بنبض إلى الحالة الصلبة 355 نانومتر الليزر لتشريح 10،000 الشعيرات الدموية لكل ماوس والمنجنيق تشريح الشعيرات الدموية في غطاء لاصق أنبوب microfuge. كما هو موضح، لوحظ فقدان كامل للضخ الخلفي مباشرة بعد تحريض الإقفاريات الخلفية. وأظهر التقييم الكمي لتدفق الدم، الذي تم التعبير عنه كنسبة من مركز الدراسات الدولية إلى طرف المجلس الوطني للأطراف، زيادة كبيرة في ضخ الدم في الأطراف في الفئران المعرضة للتحفيز المؤيِّن للأوعية في الأيام 15 و45 بعد المرحلة الـ 45 من مرحلة ما بعد المرحلة الهُنية.
يبين القياس الكمي للعيوش الدموية الإيجابية CD31 في أقسام الأنسجة النسيجية في الأنسجة العضلية في الجهاز الهضمي أن كثافة الشعيرات الدموية أكبر في الإقفاري مقابل الطرف غير الإقفاري. كما هو متوقع. ولكن هذا التأثير هو مزيد من تضخيم بعد العلاج مع عامل الموالية للأوعية.
كما أن كثافة الأوعية الجانبية تزداد باستمرار في الطرف الإقفاري وهذه الزيادة أعلى بكثير بعد التعرض للمحفزات المؤيدة للأوعية. عكس تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل المتسلسل للمؤازر الجيني في الخلايا البطانية الإيجابية CD31 يوضح تباينًا واضحًا في التعبير الجيني بين الفئران المعرضة أو غير المعرضة للعامل الموالي للأوعية. من المهم استخدام إبرة العيون الأقدم لفتح الغتمة الغشاء iliofemoral لتجنب تمزق الشريان والوريد أثناء تشريح السفينة.
السفينة يستجيب لاقفوية hindlimb في تقييمها بسهولة من قبل دوبلر الليزر تستند قياسات الضخ والكم النسيجي لكثافة الأوعية الدموية يسمح لنا لتقييم الأوعية الدموية.
