O objetivo geral deste experimento, nosso modelo de isquemia hindlimb é iluminar o experimento como base para uma avaliação abrangente dos efeitos funcionais, histológicos e moleculares dos agentes angiogênicos putativos. Este protocolo é um padrão para o teste de possíveis terapias angiogênicas em um pequeno modelo animal com potencial para aplicações futuras no contexto clínico. Como a revascularização não é adequada em vinte a trinta por cento dos pacientes críticos de isquemia A angiogênese terapêutica surgiu como uma nova estratégia para melhorar a profusão sanguínea no sítio isquêmico.
Este protocolo experimental poderia fornecer uma compreensão abrangente dos mecanismos pelos quais as terapias angiogênicas exercem seus efeitos na medida de sua eficácia em cada um de seus desfechos. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato preto C57 de 22 semanas, raspe o cabelo da plataforma traseira direita e fixe o animal na posição dorsal para cubitus em uma almofada aquecida. Coloque o animal sob um microscópio dissecando.
E use uma lâmina de bisturi cirúrgica número onze para fazer uma incisão de pele de um centímetro sobre a coxa da parte traseira direita. Dissecar a gordura subcutânea para expor o feixe neurovascular. E use fórceps pontiagudas, tesouras de mola e um suporte de agulha oftálmica para abrir a bainha ileofemoral membrana para expor os vasos ilímicos externos distal e femorais.
Após dissecar e separar a artéria e a veia do nervo, use sete suturas de polipropileno nãoabsorbáveis O para ligar a artéria femoral distal e a veia e a artéria ilíaca externa distal. A identificação da artéria ilíaca externa distal e a ligadura e excisão da artéria e veias distal externas ilíacas e femorais são fundamentais para o sucesso do procedimento. Use a tesoura de mola para transectar o segmento da artéria iliofemoral e veias entre os nós distal e proximal.
E feche a incisão com uma sutura absorvível. Em seguida, inter-peritoneally entregar solução antisedativa no animal e devolver o rato para sua gaiola de origem com monitoramento até a recuperação completa. Para colher os músculos gastrocnemius, remova a pele de ambos os barras.
E use o cotonete para separar a pele dos músculos. Segurando o tendão de aquiles, use a tesoura de mola para separar o músculo da tíbia e da fíbula até a articulação do joelho. E separar o bíceps femoris do músculo gastrocnemius.
Use a tesoura de mola para cortar as inserções do músculo gastrocnemius no nível articular do joelho. E use 10% de trigasanto para posicionar os músculos colhidos em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça. Em seguida, congele as amostras em isóperia resfriada de nitrogênio líquido por menos 80 graus Celsius de armazenamento.
Para captura de laser de microdisseção capilar, depois de obter 12 seções de micrômetros das amostras musculares, fixar os tecidos nas lâminas em 50 mililitros de acetona pura resfriado por cinco minutos a menos vinte graus Celsius. Após a secagem do ar e circule cada espécime com uma caneta hidrofóbica. E reidratar as amostras com dois cloreto de sódio molar em PBS a quatro graus Celsius.
Ao final da re-hidratação, rotule as amostras com o anticorpo primário apropriado de interesse a quatro graus Celsius durante a noite. Seguido por duas lavagens de três minutos em dois cloretos de sódio molar fresco em PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, rotule as seções com um anticorpo secundário apropriado por trinta minutos a quatro graus celsius seguido de duas lavagens em cloreto de sódio em PBS, como demonstrado.
Em seguida, rotule as amostras com complexo de peroxidase conjugado avidin por trinta minutos a quatro graus celsius. Seguido de uma lavagem e cinco minutos de rotulagem com substrato de peroxidase DAB. Ao final da incubação, desidratar os tecidos em gelo sequencial frio 90% etanol e emersions 100% etanol.
Em seguida, use um sistema de microdissecção posterior, equipado com um pulso para sólido laser de 355 nanômetros para dissecar 10.000 capilares por rato e catapultar os capilares dissecados em uma tampa adesiva do tubo de microfuge. Como ilustrado, uma perda completa de perfusão de grão-de-perna traseira é observada imediatamente após a indução da isquemia hindlimb. A avaliação quantitativa do fluxo sanguíneo, expressa como uma razão do MEMBRO ISC para o NISC, demonstrou uma perfusão de sangue de membro significativamente melhorada em camundongos expostos ao estímulo pró-angiogênico nos dias 15 e 45 pós-HLI.
A quantificação de capilares positivos CD31 em seções histológicas de seções de tecido muscular gastrocnemius mostra que a densidade capilar é maior no membro isquêmico versus não isquêmico. Como esperado. Mas esse efeito é ainda mais amplificado após o tratamento com o agente pró-angiogênico.
A densidade do vaso colateral também aumenta consistentemente no membro isquêmico e esse aumento é significativamente maior após a exposição com o estímulo pró-angiogênico. A análise de reação em cadeia de transcriptase reversa da expressão genética pró-angiogênica nas células endoteliais positivas do CD31 demonstra uma clara variação na expressão genética entre camundongos expostos ou não ao agente pró-angiogênico. É importante usar uma agulha oftálmica mais antiga para abrir a bainha iliofemoral membrana para evitar o rompimento da artéria e da veia durante a dissecção do vaso.
O vaso responde à isquemia de subida traseira no prontamente avaliado por medições de perfusão baseadas em doppler laser e a quantificação histológica da densidade do vaso capilar nos permite avaliar a angiogênese.
