El objetivo general de este experimento, nuestro modelo de isquemia de la extremidad posterior es iluminar el experimento una base para una evaluación integral de los efectos funcionales, histológicos y moleculares de los agentes angiogénicos putativos. Este protocolo tiene un estándar para el ensayo de posibles terapias angiogénicas en un modelo animal pequeño con potencial para futuras aplicaciones en el contexto clínico. Como la revascularización no es adecuada en el veinte al treinta por ciento de los pacientes críticos de isquemia, la angiogénesis terapéutica ha surgido como una nueva estrategia para mejorar la profusión de sangre en el sitio isquémico.
Este protocolo experimental podría proporcionar una comprensión integral de los mecanismos por los cuales las terapias angiogénicas ejercen sus efectos en la medida de su eficacia en cada uno de sus resultados. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un C57 negro de 22 semanas de edad, afeitar el cabello de la extremidad posterior derecha y asegurar el animal en la posición dorsal a cubito en una almohadilla calentada. Coloque al animal bajo un microscopio de disección.
Y usa una hoja de bisturí quirúrgico número once para hacer una incisión cutánea de un centímetro sobre el muslo de la extremidad posterior derecha. Blunt disecciona la grasa subcutánea para exponer el haz neurovascular. Y utilice fórceps puntiagudos, tijeras de resorte y un soporte de aguja oftálmica para abrir la funda ileofemoral membrana para exponer los vasos ilíacos y femorales externos distales.
Después de diseccionar y separar la arteria y la vena del nervio, utilice siete suturas de polipropileno no absorbibleS O para ligar la arteria femoral distal y la vena y la arteria ilíaca externa distal y la vena. La identificación de la arteria ilíaca externa distal y la ligadura y escisión de la arteria y venas ilíacos externas y femorales distales son fundamentales para el éxito del procedimiento. Utilice las tijeras de resorte para transectar el segmento de la arteria iliofemoral y las venas entre los nudos distales y proximales.
Y cierre la incisión con una sutura absorbible. A continuación, entregue inter peritonealmente la solución antisedativa en el animal y devuelva el ratón a su jaula doméstica con monitoreo hasta la recuperación completa. Para cosechar los músculos gastrocnemius, retire la piel de ambas extremidades posteriores.
Y usa el hisopo de algodón para separar la piel de los músculos. Sosteniendo el tendón de Aquiles, usa las tijeras de resorte para separar el músculo de la tibia y el peroné hasta la articulación de la rodilla. Y separa el bíceps femoris del músculo gastrocnemius.
Utilice las tijeras de resorte para cortar las inserciones del músculo gastrocnemius a nivel de la articulación de la rodilla. Y usa 10%trigasanth para colocar los músculos cosechados en una orientación transversal en un pequeño disco de corcho. A continuación, congele las muestras en isopentano refrigerado por nitrógeno líquido durante menos 80 grados centígrados de almacenamiento.
Para la captura láser de microdisección capilar, después de obtener 12 secciones de micrómetros de las muestras musculares, fije los tejidos a los portaobjetos en 50 mililitros de acetona pura enfriada durante cinco minutos a menos veinte grados centígrados. Después de secar al aire y rodear cada espécimen con una pluma hidrófoba. Y rehidrate las muestras con dos molares de cloruro de sodio en PBS a cuatro grados celsius.
Al final de la rehidratación, etiquete las muestras con el anticuerpo primario adecuado de interés a cuatro grados centígrados durante la noche. Seguido de dos lavados de tres minutos en cloruro de sodio fresco de dos molares en PBS por lavado. Después del segundo lavado, etiquete las secciones con un anticuerpo secundario adecuado durante treinta minutos a cuatro grados centígrados seguidos de dos lavados en cloruro de sodio en PBS como se ha demostrado.
A continuación, etiquete las muestras con complejo de peroxidasa conjugada con avidina durante treinta minutos a cuatro grados centígrados. Seguido de un lavado y cinco minutos de etiquetado con sustrato de lexidasa DAB. Al final de la incubación, deshidratar los tejidos en hielo frío secuencial 90%etanol y 100%etanol emersions.
A continuación, utilice un sistema de microdisección posterior, equipado con un pulso a estado sólido láser de 355 nanómetros para diseccionar 10.000 capilares por ratón y catapultar los capilares de disecúpon en una tapa adhesiva de tubo de microfuge. Como se ilustra, se observa una pérdida completa de perfusión de la extremidad posterior inmediatamente después de la inducción de la isquemia de las extremidades posteriores. La evaluación cuantitativa del flujo sanguíneo, expresada como una relación entre la extremidad ISC y la extremidad NISC, demostró una perfusión significativamente mejorada de sangre en las extremidades en ratones expuestos al estímulo pro-angiogénico en los días 15 y 45 después de la HLI.
La cuantificación de los capilares positivos CD31 en secciones histológicas de las secciones del tejido muscular gastrocnemius muestra que la densidad capilar es mayor en la extremidad isquémica frente a la extremidad no isquémica. Como era de esperar. Pero este efecto se amplifica aún más después del tratamiento con el agente pro-angiogénico.
La densidad colateral de los vasos también aumenta constantemente en la extremidad isquémica y este aumento es significativamente mayor después de la exposición con el estímulo pro-angiogénico. El análisis de reacción en cadena de la transcriptasa polimerasa inversa de la expresión génica pro-angiogénica en células endoteliales positivas CD31 demuestra una clara variación en la expresión génica entre ratones expuestos o no al agente pro-angiogénico. Es importante utilizar una aguja oftálmica más antigua para abrir la vaina iliofemoral membrana para evitar el desgarro de la arteria y la vena durante la disección del vaso.
El recipiente responde a la isquemia de las extremidades posteriores en las mediciones de perfusión basadas en doppler láser fácilmente evaluadas y la cuantificación histológica de la densidad del vaso capilar nos permite evaluar la angiogénesis.
