Общая цель этого эксперимента, наша модель ишемии хиндлимба заключается в освещении эксперимента в качестве основы для всесторонней оценки функциональных, гистологических и молекулярных эффектов ангиогенных агентов. Этот протокол поля стандарт для тестирования возможных ангиогенных методов лечения в модели малых животных с потенциалом для будущих применений в клиническом контексте. Поскольку реваскуляризация не подходит в двадцать-тридцать процентов критических больных ишемией Терапевтический ангиогенез стал новой стратегией для улучшения изобилия крови в ишемическом месте.
Этот экспериментальный протокол мог бы обеспечить всестороннее понимание механизмов, с помощью которых ангиогенные методы лечения оказывают свое воздействие в меру их эффективности на каждом из их результатов. После подтверждения отсутствия ответа на щипать ног в 22-недельный C57 черный шесть самок мыши, брить волосы из правой задней и обеспечить животное в спинной кубитус позиции на нагретой площадке. Поместите животное под рассечение микроскопа.
И использовать номер одиннадцать хирургического лезвия скальпеля, чтобы сделать один сантиметр разреза кожи над бедром правой задней. Блант вскрыть подкожный жир, чтобы разоблачить нервно-сосудистых расслоение. И использовать остроконечные миппы, весенние ножницы, и офтальмологический держатель иглы, чтобы открыть мембранные илеофеморальные оболочки подвергать дистального внешнего подвздошного и бедренной сосудов.
После вскрытия и отделения артерии и вены от нерва, используйте семь O неабсорбируемых полипропиленовых швов для лигата дистальной бедренной артерии и вены и дистальной внешней подвздошной артерии и вены. Выявление дистальной внешней подвздошной артерии и перевязки и иссечение дистального внешнего подвздошной кости и бедренной артерии и вен имеют решающее значение для успеха процедуры. Используйте весенние ножницы, чтобы перерезать сегмент илиофеморальной артерии и вен между дистальными и проксимальными узлами.
И закройте разрез абсорбируемым швом. Затем, межперитонно доставить антисеативное решение в животное и вернуть мышь в свою домашнюю клетку с мониторингом до полного выздоровления. Для сбора мышц гастрокнеймия, удалить кожу с обеих задних конечностей.
И использовать ватный тампон, чтобы отделить кожу от мышц. Держа ахиллово сухожилие, используйте весенние ножницы, чтобы отделить мышцу от голени и малоберцовой кости до коленного сустава. И отделить бицепс феморис от мышцы гастрокнемиуса.
Используйте весенние ножницы, чтобы сократить вставки мышцы гастрочнемиуса на уровне коленного сустава. И использовать 10%trigasanth для позиционирования собранных мышц в поперечной ориентации на небольшой пробковый диск. Затем, оснастки заморозить образцы в жидком азоте охлаждается изопентан для минус 80 градусов по Цельсию хранения.
Для захвата капиллярного микродиссекции лазером, после получения 12 микрометровых секций образцов мышц, зафиксните ткани на слайдах в 50 миллилитров охлажденого чистого ацетона в течение пяти минут при температуре минус двадцать градусов по Цельсию. После высыхания воздуха и круг каждого образца с гидрофобной ручкой. И регидратировать образцы с двумя хлорида натрия моляра в PBS при четырех градусах по Цельсию.
В конце регидратации, этикетки образцов с соответствующим первичным антителом интереса на четыре градуса цельсия в одночасье. Затем две три минуты моет в свежих двух молярных хлорида натрия в PBS за стирку. После второй стирки, этикетка разделов с соответствующим вторичным антителом в течение тридцати минут при четырех градусах по Цельсию, а затем два моет хлорида натрия в PBS, как попродемонстрировано.
Далее, этикетка образцов с avidin конъюгированных пероксидазы комплекса в течение тридцати минут при четырех градусах по Цельсию. Затем мыть и пять минут маркировки с DAB peroxidase субстрата. В конце инкубации, обезвоживать ткани в последовательной ледяной 90% этанола и 100% этанола emersions.
Затем используйте более ближированную систему микроперепись, оснащенную импульсом к твердому 355 нанометровому лазеру, чтобы вскрыть 10 000 капилляров на мышь и катапультировать вскрытые капилляры в клеевую крышку микрофуг-трубки. Как показано на примере, полная потеря перфузии хиндлимба наблюдается сразу после индукции ишемии задней части. Количественная оценка кровотока, выраженная как отношение ISC к конечности NISC, продемонстрировала значительно увеличенную перфузию крови конечностей у мышей, подвергшихся проангиогенным стимулам в дни 15 и 45 после HLI.
Количественная оценка CD31 положительные капилляры в гистологических разделах желудочно-кишечной ткани разделы показывает, что плотность капилляров больше в ишемической по сравнению с неишемической конечности. Как и ожидалось. Но этот эффект еще больше усиливается после лечения проангиогенным агентом.
Плотность коллатеральной сосуда также постоянно увеличивается в ишемической конечности, и это увеличение значительно выше после воздействия с проангиогенным стимулом. Обратный транскриптаза полимеразной цепной реакции анализа проангиогенной экспрессии генов в CD31 положительные эндотелиальные клетки демонстрирует явную вариацию экспрессии генов между мышами подвергаются или нет проангиогенного агента. Важно использовать офтальмологическую иглу старше, чтобы открыть мембранную илиофеморную оболочку, чтобы избежать разрыва артерии и вены во время вскрытия сосуда.
Сосуд реагирует на ишемию заднего мозга в легко оцениваемых лазерных доплеровских измерениях перфузии и гистологической количественной оценке плотности капиллярного сосуда, что позволяет оценить ангиогенез.
