המטרה הכוללת של ניסוי זה, מודל ה ischemia hindlimb שלנו היא להדליק את הניסוי בסיס להערכה מקיפה של ההשפעות התפקודיות, ההיסטולוגיות והמולקולריות של סוכנים אנגיוגניים putative. פרוטוקול זה שדות תקן לבדיקת טיפולים אנגיוגניים אפשריים במודל בעלי חיים קטנים עם פוטנציאל ליישומים עתידיים בהקשר הקליני. כמו revascularization אינו מתאים עשרים עד שלושים אחוזים של חולי איסכמיה קריטיים אנגיוגנזה טיפולית התפתחה כאסטרטגיה חדשנית לשיפור שפע הדם באתר איסכמי.
פרוטוקול ניסיוני זה יכול לספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגניים להפעיל את השפעתם במידה של יעילותם בכל אחת מתוצאותיהם. לאחר שאישר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר שחור בן 22 שבועות C57 שש נקבה, לגלח את השיער מן hindlimb הימני ולהבטיח את החיה בדור כדי עמדת cubitus על כרית מחוממת. מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ לנתח.
ולהשתמש בלהב אזמל כירורגי מספר 11 כדי להפוך חתך עור סנטימטר אחד מעל הירך של hindlimb הימני. קהה לנתח את השומן התת עורי לחשוף את הצרור הנוירו-וסקולרי. ולהשתמש במטליות מחודדות, מספריים אביביים, ומחזיק מחט עיניים כדי לפתוח את נדן האילופרמורל הממברני כדי לחשוף את האיליאק החיצוני הדיסטלי וכלי הירך.
לאחר ניתוח והפרדת העורק והווריד מהעצב, השתמשו בשבעה תפרי פוליפרופילן O שאינם ניתנים לניתוק כדי ללקט את עורק העובר והווריד הדיסטלי ואת עורק האיליאק החיצוני והווריד. זיהוי עורק האליגה החיצוני הדיסטלי והליגה והניתוס של האליג החיצוני הדיסטלי ועורק הירך והוורידים הם קריטיים להצלחת ההליך. השתמש במספריים האביב כדי לשנות את החלק של העורק iliofemoral וורידים בין הקשרים דיסטלי proximal.
ולסגור את החתך עם תפר נספג. לאחר מכן, בין-צפי לספק פתרון antisedative לתוך החיה ולהחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. כדי לקצור את שרירי gastrocnemius, להסיר את העור משני hindlimbs.
ולהשתמש ספוגית כותנה כדי להפריד את העור מן השרירים. מחזיק את גיד אכילס, להשתמש במספריים באביב כדי להפריד את השריר מן השוקה ואת השוקית עד מפרק הברך. ולהפריד את שרירי הירך מהשריר gastrocnemius.
השתמש מספריים האביב לחתוך את ההכנסות של שריר gastrocnemius ברמת מפרק הברך. ולהשתמש 10% trigasanth למקם את השרירים שנקטפו בכיוון רוחבי על דיסק פקק קטן. לאחר מכן, הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי מקורר isopentane עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.
עבור לכידת לייזר microdissection נימי, לאחר קבלת 12 חלקים מיקרומטר של דגימות השריר, לתקן את הרקמות לשקופיות ב 50 מיליליטר של אצטון טהור מקורר במשך חמש דקות במינוס עשרים מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש האוויר ומקיף כל דגימה בעט הידרופובי. ולייבש מחדש את הדגימות עם שני נתרן כלורי טוחן ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף ההידרציה מחדש, סמן את הדגימות בנוגדן העיקרי המתאים לעניין בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ואחריו שתי שלוש דקות שוטף טרי שני נתרן כלורי טוחן ב PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, סמן את החלקים בנוגדן משני מתאים במשך שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שתי שטיפות בנתרן כלורי ב- PBS כפי שהוכח.
לאחר מכן, סמן את הדגימות עם מתחם פרוקסידזה אצמוי אבידין במשך שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואחריו שטיפה וחמש דקות של תיוג עם מצע peroxidase DAB. בסוף הדגירה, לייבש את הרקמות בקרח רציף קר 90% אתנול ו 100% אמרסי אתנול.
לאחר מכן, השתמש במערכת microdissection מאוחר יותר, מצויד פולס למצב מוצק 355 לייזר ננומטר לנתח 10, 000 נימים לכל עכבר להזניק את נימי לנתח לתוך כובע דבק צינור microfuge. כפי שמודגם, אובדן מוחלט של תדלוק hindlimb נצפתה מיד לאחר אינדוקציה איסקימיה hindlimb. הערכה כמותית של זרימת הדם, שבאה לידי ביטוי כיחס בין ISC לאיבר NISC, הוכיחה חליטת דם גפיים משופרת באופן משמעותי בעכברים שנחשפו לגירוי הפרו-אנגיגני בימים 15 ו -45 לאחר HLI.
כימות נימים חיוביים CD31 בחלקים היסטולוגיים של חלקי רקמת שריר gastrocnemius מראה כי צפיפות נימי גדול יותר באיבר איסכמי לעומת האיבר הלא איסכמי. כצפוי. אבל אפקט זה מוגבר עוד יותר לאחר הטיפול עם הסוכן pro-angiogenic.
צפיפות כלי המשנה גם עולה באופן עקבי באיבר האיסכמי ועלייה זו גבוהה משמעותית לאחר החשיפה לגירוי הפרו-אנגיוגניים. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז תעתיק הפוך של ביטוי גנים פרו-אנגיוגניים בתאי אנדותל חיוביים CD31 מדגים וריאציה ברורה בביטוי גנים בין עכברים שנחשפו או לא לסוכן הפרו-אנגיוגני. חשוב להשתמש במחט עיניים מבוגרת יותר כדי לפתוח את נדן iliofemoral קרום, כדי למנוע קריעת העורק והווריד במהלך ניתוח הכלי.
הכלי מגיב איסכמיה hindlimb בהערכה בקלות על ידי מדידות זלוש מבוסס דופלר לייזר ואת כימות היסטולוגי של צפיפות כלי נימי מאפשר לנו להעריך את אנגיוגנזה.
